私たちのプロトコルは、眼の形態形成のプロセスが正常および病理学的状態の両方でどのように起こるかについての視覚的およびリアルタイムの両方の情報を提供します。当社のプロトコルにより、Zスタックの迅速な取得が可能になり、データセット内の各3D画像間の時間が短縮されます。これは、眼の形態形成がどのように起こるかの時間的分解能の増加を提供する。
毛細血管内に胚を配置することは、単一のソマイト段階での球形のために困難な場合があるため、少なくとも1つが正しい向きにあることを確認するために、複数の胚を毛細血管にロードすることが重要です。受精後10時間でソマイトの存在をスクリーニングするには、胚を実体顕微鏡下に置き、蛍光アダプターを使用してrx3:GFP導入遺伝子の存在を確認する。3〜5個のGFP陽性単一ソマイト胚が同定されたら、微細な鉗子を使用して胚を装飾する。
胚をアガロースに埋め込むには、500マイクロリットルのE3胚バッファーを含む微量遠心チューブに胚を移し、1ミリリットル当たり168マイクログラムのトリカインを添加し、冷却されたが液体の2%低い融解温度のアガロースおよびE3バッファーを500マイクロリットルを穏やかに混合しながらチューブに加える。PTFEプランジャーを備えた1ミリメートルのガラスキャピラリーを使用して、アガロース包埋胚をキャピラリーに引き込み、室温で30〜60秒間アガロースを固化させます。次に、毛細血管をトリカイン補充E3バッファーのビーカーに入れます。
胚イメージング用のライトシート顕微鏡をセットアップするには、キャピラリーサンプルホルダーにキャピラリーを置き、ホルダーの金属ディスクの中央にある金属シースをクリックします。スリットがシースの端を向くように2つのゴム栓をシースに入れ、ゴム栓の中央を通って毛細血管をスライドさせます。マーカーが金属シースの基部に収まったら、金属製のキャップを使用してキャピラリーを所定の位置に固定し、白いマークが揃った状態で顕微鏡の上部にホルダーを置きます。
サンプルホルダーの蓋を閉じ、顕微鏡ソフトウェアインターフェースのキャピラリー位置ボタンをクリックします。エルゴドライブコントロールパネルを使用して、キャピラリーを目標のすぐ上に移動します。蓋を開けた後、胚を含むアガロースの断面が対物レンズの前の毛細血管底の下に垂れ下がるまでプランジャーを静かに押します。
「キャピラリーの位置」をオフにして「サンプルの検索」をクリックして、サンプルチャンバーのウェブカメラから顕微鏡対物レンズにビューを切り替え、このビューを使用してサンプルの位置をより正確に調整します。次に、サンプルの位置を特定し、取得タブに切り替えます。Z スタックと時系列のチェックボックスをオンにします。
集録モードパラメータウィンドウで、デュアルサイドライトシート設定を選択し、オンラインデュアルサイドフュージョンとピボットスキャンのチェックボックスをオンにします。連続をクリックして、胚のライブビューを取得します。チャンネルのウィンドウで、[488チャンネル]を選択し、レーザー出力を1に設定し、露光時間を7.5ミリ秒に設定します。
Ergo Driveコントロールパネルを使用して、眼球がカメラと直接向くまで胚の位置を調整し、眼球が十分に焦点を合わせるまでチャンネルパラメータの左右のライトシートを調整します。最初と最後のZ位置を、最後に検出可能な蛍光シグナルから約500マイクロメートル超えて設定し、[最適]をクリックしてステップサイズを0.477マイクロメートルに設定します。インキュベーションパラメータを設定するには、ペルチェユニットのチェックボックスをオンにして、温度を摂氏28度に保ちます。
時系列ウィンドウで、適切な実験頻度と時間間隔を選択して画像を取得します。[テストの開始] をクリックします。イメージセットを保存するフォルダを選択し、イメージプレフィックスを設定してから、「保存」をクリックしてイメージングを開始します。
画像解析を行うには、画像ファイルを適切な4D画像解析ソフトウェアプログラムにインポートし、4Dビューアキューブ、スケールバー、ビデオアイコンをクリックしてストーリーボードタスクバーを開きます。「キーフレームシーケンスを追加」を選択し、ビデオの再生時間を秒単位で指定します。[回転を作成]ボックスのチェックを外し、[時間の進行状況を使用してビデオに特定のタイムポイントを含める]をオンにします。
ストーリーボードを保存して、同じパラメーターを複数の画像セットに適用します。「ムービーをエクスポート」をクリックしてタイムラプスイメージングのビデオを保存し、ファイル名と場所、ビデオフォーマット、ビデオ解像度、フレームレート、データ解像度などのムービーエクスポート設定を指定します。必要に応じてタイムスタンプを追加し、[レコード] を選択します。
特定のポイントで回転ビデオを作成するには、先ほど説明したようにキーフレームシーケンスを追加しますが、[回転を作成]チェックボックスをオンにして、[時間の進行状況を使用]チェックボックスをオフにします。任意の方向と個々のポイントで高解像度の画像をレンダリングするには、4Dビューアでカメラアイコンを選択します。分析用のパイプラインを構築するには、フラスコを選択して分析パネルにアクセスし、[分析操作] メニューを開いて目的の操作のシーケンスを選択します。
青い三角形をクリックしてパイプラインを開始します。実行の最後に、ポップアップウィンドウでフィーチャー列をクリックして、目的のオブジェクトに関する情報を提供できるフィーチャーのリストを表示し、「エクスポート」をクリックしてデータをスプレッドシートにエクスポートします。この代表的な解析では、トランスジェニックrx3:GFP胚を、1つのソマイト段階から受精後24時間、合計14時間にわたって5分ごとに背側見晴らしの良い場所から画像化した。
観察されたように、この分析からキャプチャされた画像のパイプライン実行を実行すると、発育眼のマスクの生成が容易になった。眼野を2つの視小胞に分離すると、視床下部に寄与した前脳の第3のrx3:GFP陽性領域が観察され得ることに留意されたい。この情報はボリュームデータでも観察され、どちらの光学ベシクルでも観察されたものよりもはるかに小さいため、オプティックベシクルデータから簡単に分離できます。
この手順に続いて、追加の分析 (たとえば、画像データセット全体の個々の細胞の追跡など) を行うことができます。
