この予算に優しい磁気ビーズベースのDNA抽出プロトコルは、リソース制限のあるラボや研究にアクセスできる高スループットシーケンシングを可能にします。このプロトコルは、高品質のDNA抽出のために高価な機器を必要とせず、高スループットシーケンシングのための品質で十分な量のDNAを得ることが困難である特定の診断または研究状況で有用であり得る。このプロトコルは、1 回限りのデモで簡単に複製できます。
ワークフローを理解するには、まず少数のサンプルを試してください。まず、70%以上のアルコールに貯蔵された蚊組織サンプルを水分補給するには、100マイクロリットルのPCRグレードの水を加え、4°Cで1時間インキュベートして組織を軟化させます。インキュベーション後、水を捨て、100マイクロリットルのプロテアーゼKバッファー酵素ミックスを加えます。
次に、マイクロ遠心分離チューブの害虫を使用して、組織を均質化します。均質化後、組織を遠心分離し、摂氏56度で2〜3時間インキュベートする。DNAを抽出するために、100マイクロリットルの組織が新しいクリーンマイクロ遠心チューブにリゼートします。
次に、磁気ビーズマスターミックスの215マイクロリットルを追加します。ピペットを使用して、ライセートと磁気ビーズ混合物を10〜20秒間混ぜ、室温で10分間放置します。インキュベーション中に、時折チューブを軽く振って、DNAと磁気ビーズの結合を最大限に引き出します。
次に、溶液が明らかになるまで、マグネットビードセパレータの上にチューブを置きます。次にピペットを用いて、DNAを保持する磁気ビーズを邪魔することなく、チューブから液体を穏やかに吸引する。チューブを磁気ビーズ分離器から離し、325マイクロリットルの洗浄バッファー1を加えてビーズを洗います。
ピペットで十分に混ぜ、室温で1分間インキュベートします。インキュベーションの後、チューブを磁気ビーズ分離器に置き、前述のように上清を取り除き、チューブを磁気ビーズ分離器から離し、洗浄バッファー1でビーズを1回洗います。2回目の洗浄後、バッファー1で2回目の洗浄を行い、250マイクロリットルの洗浄バッファー2を同様にして2回洗浄する。
最後の洗浄後、チューブを磁気ビーズ分離器から離し、溶出バッファーを100マイクロリットル加えます。ピペットで十分に混ぜ合わせ、室温でチューブを2分間インキュベートしてから磁気セパレータに戻します。溶液が明らかになったら、上清を新しい0.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移し、適切に保管します。
0.5ミリモルEDTAを含む溶出緩衝液中の蚊DNAの典型的なマイクロ体積フルオメーターの読み取りとしてここに示す。平均260~280ナノメートルの吸光度比は2.3です。次の表に、さまざまな抽出方法について、1 営業日に処理されたサンプルのコストと数を示します。
このプロトコルによる抽出のための典型的な試薬および消耗品のコストは、サンプルあたり約9.50です。このコストは、一般的な磁気ビーズベースの抽出方法と同等です。このプロトコルの主なコストメリットは、自動DNA抽出装置を必要としないことです。
複数のサンプルを使用する場合は、必ずサンプル間でピペットチップを変更して、DNAのクロスコンタミネーションを防ぎます。全ゲノムシーケンシングに、この方法で抽出した高品質のDNAを用いています。現在、シーケンシングデータを使用して、公衆衛生および疾病管理における昆虫剤耐性または免疫遺伝子の新しい突然変異を同定しています。
高スループットシーケンシングのための手頃な価格のソリューションを持つことは、多くの新しい遺伝的制御戦略の成功に影響を与える蚊の分散と遺伝子の流れを理解することを目的とした集団ゲノミクスと景観ゲノミクスのためのエキサイティングな扉を開きます。
