Этот бюджетный протокол экстракции ДНК на основе магнитных шариков делает высокопроизводительное секвенирование доступным для лабораторий и исследований с ограниченными ресурсами. Этот протокол не требует дорогостоящего оборудования для высококачественной экстракции ДНК и может быть полезен в определенных диагностических или исследовательских ситуациях, когда получение достаточного количества ДНК с качеством для секвенирования с высокой пропускной способностью является сложной задачей. Этот протокол легко воспроизвести с помощью однократной демонстрации.
Сначала следует попробовать с небольшим количеством образцов, чтобы ознакомиться с рабочим процессом. Для начала увлажняйте образцы тканей комаров, хранящиеся в спирте более 70%, добавив 100 микролитров воды класса ПЦР и инкубируя в течение одного часа при четырех градусах Цельсия, чтобы смягчить ткань. После инкубации отбросьте воду и добавьте 100 микролитров буферной ферментной смеси протеиназы К.
Затем используйте микроцентрифугу трубки для гомогенизации ткани. После гомогенизации центрифугируют тканевый лисат и инкубируют в течение двух-трех часов при 56 градусах Цельсия. Для извлечения ДНК пипетка 100 микролитров ткани листирует в новую чистую микроцентрифужную трубку.
Затем добавьте 215 микролитров магнитной бисероплетения. Используя пипетку, смешайте лисат и смесь магнитных шариков в течение 10-20 секунд, затем дайте ей постоять в течение 10 минут при комнатной температуре. Во время инкубации осторожно время от времени встряхивая трубку, чтобы максимизировать связывание ДНК с магнитными шариками.
Далее поместите трубку на магнитный сепаратор шариков до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Затем, используя пипетку, осторожно аспирируйте жидкость из трубки, не нарушая магнитные шарики, удерживающие ДНК. Отодвинуть трубку от магнитного сепаратора шариков и промыть бусины, добавив 325 микролитров промывочной буферной.
Тщательно перемешайте путем пипетки и инкубируете в течение одной минуты при комнатной температуре. После инкубации поместите трубку на магнитный сепаратор бусин и удалите супернатант, как было показано ранее, затем отодвините трубку от магнитного сепаратора бусин и промыть шарики один раз с помощью промывочной буферной. После второй промывки буферной дважды помойте бусины 250 микролитрами промывки буфера двумя одинаковыми способами.
После последней промывки отодвинуть трубку от магнитного сепаратора шариков и добавить 100 микролитров буфера элюирования. Тщательно перемешайте путем пипетки, а затем инкубируете трубку в течение двух минут при комнатной температуре, прежде чем поместить ее обратно на магнитный сепаратор. Когда раствор станет прозрачным, переложите супернатант в новую, чистую 0,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и храните соответствующим образом.
Показан здесь как типичный микрообойный флуорометр, считывая показания ДНК комара в буфере элюирования, содержащем 0,5 миллимоляра ЭДТА. Средний коэффициент поглощения от 260 до 280 нанометров составляет 2,3. В этой таблице показаны затраты и количество образцов, обработанных за один рабочий день для разных методов экстракции.
Типичная стоимость реагента и расходных материалов для экстракции по этому протоколу составляет около 9,50 на образец. Эта стоимость эквивалентна любому типичному методу экстракции на основе магнитной бусины. Основная экономическая выгода этого протокола связана с тем, что он не требует автоматизированного инструмента извлечения ДНК.
Обязательно меняйте наконечники пипетки между образцами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение ДНК при работе с несколькими образцами. Мы используем высококачественную ДНК, извлеченную с помощью этого метода, для секвенирования всего генома. В настоящее время мы используем данные секвенирования для выявления новых мутаций в резистентности к инсектицидам или иммунных генах, вызывающих озабоченность в области общественного здравоохранения и борьбы с болезнями.
Наличие доступных решений для высокопроизводительного секвенирования открывает захватывающие двери для популяционной геномики и ландшафтной геномики, направленных на понимание рассеивания комаров и потока генов, что влияет на успех многих новых стратегий генетического контроля.
