Questo protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche a basso budget rende il sequenziamento ad alta produttività accessibile a laboratori e studi limitati alle risorse. Questo protocollo non richiede apparecchiature costose per l'estrazione del DNA di alta qualità e può essere utile in determinate situazioni diagnostiche o di ricerca in cui ottenere una quantità sufficiente di DNA con una qualità per il sequenziamento ad alta produttività è impegnativo. Questo protocollo è facile da replicare con una dimostrazione una sola volta.
Dovrebbe essere provato prima con un piccolo numero di campioni per familiarizzare con il flusso di lavoro. Per iniziare, idratare i campioni di tessuto di zanzara conservati in più del 70% di alcol aggiungendo 100 microlitri di acqua di grado PCR e incubando per un'ora a quattro gradi Celsius per ammorbidire il tessuto. Dopo l'incubazione, scartare l'acqua e aggiungere 100 microlitri di miscela enzimatica tampone Proteinasi K.
Quindi utilizzare un pestello del tubo di microcentrifugo per omogeneizzare il tessuto. Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare il lisato tissutale e incubare per due o tre ore a 56 gradi Celsius. Per estrarre il DNA, pipettare 100 microlitri del tessuto si lisce in un nuovo tubo di microcentrifugo pulito.
Quindi aggiungere 215 microlitri del mix di master perline magnetiche. Utilizzando una pipetta, mescolare il lisato e la miscela di perline magnetiche per 10-20 secondi, quindi lasciarlo riposare per 10 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, agitare delicatamente il tubo di tanto in tanto per massimizzare il legame del DNA alle perline magnetiche.
Quindi, posizionare il tubo sul separatore magnetico delle perline fino a quando la soluzione non diventa chiara. Quindi, utilizzando una pipetta, aspirare delicatamente il liquido dal tubo senza disturbare le perline magnetiche che tengono il DNA. Allontanare il tubo dal separatore magnetico delle perline e lavare le perline aggiungendo 325 microlitri di tampone di lavaggio uno.
Mescolare accuratamente con pipettazione e incubare per un minuto a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, posizionare il tubo sul separatore magnetico delle perline e rimuovere il supernatante come precedentemente dimostrato, quindi allontanare il tubo dal separatore magnetico delle perline e lavare le perline una volta con il tampone di lavaggio uno. Dopo il secondo lavaggio con tampone uno, lavare le perline due volte con 250 microlitri di tampone di lavaggio due nello stesso modo.
Dopo l'ultimo lavaggio, allontanare il tubo dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione. Mescolare accuratamente con pipettazione e quindi incubare il tubo per due minuti a temperatura ambiente prima di riposizionare sul separatore magnetico. Quando la soluzione diventa chiara, trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo da 0,5 millilitri pulito e conservare in modo appropriato.
Mostrato qui come una tipica lettura del fluorometro a microvolume del DNA della zanzara in un tampone di eluizione contenente EDTA da 0,5 millimolare. Il rapporto medio di assorbanza da 260 a 280 nanometri è di 2,3. Questa tabella mostra i costi e il numero di campioni elaborati in un giorno lavorativo per diversi metodi di estrazione.
Il tipico costo del reagente e dei materiali di consumo per un'estrazione da parte di questo protocollo è di circa 9,50 per campione. Questo costo è equivalente a qualsiasi metodo tipico di estrazione a base di perline magnetiche. Il principale vantaggio in termini di costi di questo protocollo deriva dal fatto che non è necessario lo strumento di estrazione automatica del DNA.
Assicurarsi di cambiare le punte delle pipette tra i campioni per prevenire la contaminazione incrociata del DNA quando si lavora con più campioni. Usiamo il DNA di alta qualità estratto usando questo metodo per il sequenziamento dell'intero genoma. Attualmente stiamo utilizzando i dati di sequenziamento per identificare nuove mutazioni nella resistenza agli insetticidi o geni immunitari che desta preoccupazione nella salute pubblica e nel controllo delle malattie.
Avere soluzioni convenienti per il sequenziamento ad alta produttività apre porte entusiasmanti per la genomica della popolazione e la genomica del paesaggio volte a comprendere la dispersione delle zanzare e il flusso genico che influenza il successo di molte nuove strategie di controllo genetico.
