Dieses budgetfreundliche DNA-Extraktionsprotokoll auf Basis magnetischer Perlen macht die Sequenzierung mit hohem Durchsatz für ressourcenbeschmierte Labore und Studien zugänglich. Dieses Protokoll erfordert keine teure Ausrüstung für eine qualitativ hochwertige DNA-Extraktion und kann in bestimmten Diagnose- oder Forschungssituationen hilfreich sein, in denen es schwierig ist, eine ausreichende Menge an DNA mit einer Qualität für die Hochdurchsatzsequenzierung zu erhalten. Dieses Protokoll ist mit einer einmaligen Demonstration einfach zu replizieren.
Es sollte zuerst mit einer kleinen Anzahl von Beispielen versucht werden, um sich mit dem Workflow vertraut zu machen. Hydratisieren Sie zunächst die in mehr als 70% Alkohol gelagerten Mückengewebeproben, indem Sie 100 Mikroliter PCR-Wasser hinzufügen und eine Stunde lang bei vier Grad Celsius inkubieren, um das Gewebe zu erweichen. Nach der Inkubation das Wasser entsorgen und 100 Mikroliter Proteinase K Pufferenzymmischung hinzufügen.
Verwenden Sie dann einen Mikrozentrifugenschlauchstößel, um das Gewebe zu homogenisieren. Nach der Homogenisierung zentrifugieren Sie das Gewebelysat und inkubieren Sie es zwei bis drei Stunden bei 56 Grad Celsius. Um DNA zu extrahieren, pipetten Sie 100 Mikroliter des Gewebelysats in ein neues sauberes Mikrozentrifugenröhrchen.
Fügen Sie dann 215 Mikroliter der magnetischen Perlen-Mastermischung hinzu. Mischen Sie mit einer Pipette das Lysat und das magnetische Perlengemisch für 10 bis 20 Sekunden und lassen Sie es dann 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Schütteln Sie das Röhrchen während der Inkubation gelegentlich sanft, um die Bindung der DNA an die magnetischen Perlen zu maximieren.
Als nächstes legen Sie das Röhrchen auf den magnetischen Perlenabscheider, bis die Lösung klar ist. Dann mit einer Pipette die Flüssigkeit vorsichtig aus dem Röhrchen absaugen, ohne die magnetischen Perlen zu stören, die die DNA halten. Bewegen Sie das Röhrchen vom magnetischen Perlenabscheider weg und waschen Sie die Perlen, indem Sie 325 Mikroliter Waschpuffer eins hinzufügen.
Durch Pipettieren gründlich mischen und eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie nach der Inkubation das Röhrchen auf den magnetischen Perlenabscheider und entfernen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt, bewegen Sie dann das Rohr vom Magnetperlenabscheider weg und waschen Sie die Perlen einmal mit einem Waschpuffer. Nach der zweiten Wäsche mit Puffer eins waschen Sie die Perlen zweimal mit 250 Mikrolitern Waschpuffer zwei auf die gleiche Weise.
Nach der letzten Wäsche bewegen Sie das Röhrchen vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie 100 Mikroliter Elutionspuffer hinzu. Mischen Sie das Röhrchen gründlich durch Pipettieren und inkubieren Sie es dann zwei Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie es wieder auf den Magnetabscheider legen. Wenn die Lösung klar ist, den Überstand in ein neues, sauberes 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben und entsprechend lagern.
Hier als typische Mikrovolumenfluorometer-Ablesung der Mücken-DNA in einem Elutionspuffer mit 0,5 Millimolar-EDTA dargestellt. Das durchschnittliche Absorptionsverhältnis von 260 bis 280 Nanometern beträgt 2,3. Diese Tabelle zeigt die Kosten und die Anzahl der an einem Arbeitstag verarbeiteten Proben für verschiedene Extraktionsmethoden.
Die typischen Reagenzien- und Verbrauchsmaterialkosten für eine Extraktion nach diesem Protokoll betragen etwa 9,50 pro Probe. Diese Kosten entsprechen jeder typischen Extraktionsmethode auf Basis magnetischer Perlen. Der größte Kostenvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass das automatisierte DNA-Extraktionsinstrument nicht erforderlich ist.
Stellen Sie sicher, dass Sie die Pipettenspitzen zwischen den Proben wechseln, um eine Kreuzkontamination der DNA bei der Arbeit mit mehreren Proben zu vermeiden. Wir verwenden die hochwertige DNA, die mit dieser Methode extrahiert wird, für die Sequenzierung des gesamten Genoms. Wir verwenden derzeit die Sequenzierungsdaten, um neuartige Mutationen in Insektizidresistenzen oder Immungenen zu identifizieren, die für die öffentliche Gesundheit und Krankheitskontrolle von Belang sind.
Erschwingliche Lösungen für die Hochdurchsatzsequenzierung öffnen aufregende Türen für die Populationsgenomik und Landschaftsgenomik, die darauf abzielen, die Ausbreitung von Moskitos und den Genfluss zu verstehen, was den Erfolg vieler neuartiger genetischer Kontrollstrategien beeinflusst.
