Este protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas amigável ao orçamento torna o sequenciamento de alto rendimento acessível a laboratórios e estudos limitados de recursos. Este protocolo não requer equipamentos caros para extração de DNA de alta qualidade e pode ser útil em certas situações de diagnóstico ou pesquisa onde a obtenção de uma quantidade suficiente de DNA com uma qualidade para sequenciamento de alto rendimento é um desafio. Este protocolo é fácil de replicar com uma demonstração única.
Ele deve ser experimentado com um pequeno número de amostras primeiro para se familiarizar com o fluxo de trabalho. Para começar, hidrate as amostras de tecido do mosquito armazenadas em mais de 70% de álcool adicionando 100 microliters de água de grau PCR e incubando por uma hora a quatro graus Celsius para suavizar o tecido. Após a incubação, descarte a água e adicione 100 microliters de proteinase K mistura de enzima tampão.
Em seguida, use um pilão de tubo de microcentrifuge para homogeneizar o tecido. Após a homogeneização, centrifugar o tecido lise e incubar por duas a três horas a 56 graus Celsius. Para extrair DNA, pipetas 100 microliters do tecido lysate em um novo tubo de microcentrifuge limpo.
Em seguida, adicione 215 microliters da mistura mestre de contas magnéticas. Com uma pipeta, misture o liseto e a mistura de contas magnéticas por 10 a 20 segundos e deixe-a descansar por 10 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação, agite suavemente o tubo ocasionalmente para maximizar a ligação do DNA às contas magnéticas.
Em seguida, coloque o tubo no separador de contas magnéticas até que a solução fique clara. Em seguida, usando uma pipeta, aspire suavemente o líquido do tubo sem perturbar as contas magnéticas que seguram o DNA. Mova o tubo para longe do separador de contas magnéticas e lave as contas adicionando 325 microliters de tampão de lavagem um.
Misture bem por pipetar e incubar por um minuto à temperatura ambiente. Após a incubação, coloque o tubo no separador de contas magnéticas e remova o supernatante como demonstrado anteriormente, em seguida, mova o tubo para longe do separador de contas magnéticas e lave as contas uma vez com tampão de lavagem. Após a segunda lavagem com tampão, lave as contas duas vezes com 250 microliters de tampão de lavagem dois da mesma maneira.
Após a última lavagem, mova o tubo para longe do separador de contas magnéticas e adicione 100 microliters de tampão de elução. Misture bem por pipetar e, em seguida, incubar o tubo por dois minutos à temperatura ambiente antes de colocá-lo de volta no separador magnético. Quando a solução ficar clara, transfira o supernante para um novo tubo de microcentrífugo de 0,5 mililitro e armazene adequadamente.
Mostrado aqui como uma leitura típica do fluorômetro de microvolume do DNA do mosquito em um tampão de elução contendo 0,5 milimólares EDTA. A taxa média de absorção de 260 a 280 nanômetros é de 2,3. Esta tabela mostra os custos e o número de amostras processadas em um dia útil para diferentes métodos de extração.
O custo típico de reagente e consumível para uma extração por este protocolo é de cerca de 9,50 por amostra. Este custo é equivalente a qualquer método típico de extração baseada em contas magnéticas. O maior custo benefício deste protocolo vem da não exigência do instrumento automatizado de extração de DNA.
Certifique-se de alterar as pontas da pipeta entre as amostras para evitar a contaminação cruzada do DNA ao trabalhar com várias amostras. Usamos o DNA de alta qualidade extraído usando este método para sequenciamento de genoma inteiro. Atualmente estamos usando os dados de sequenciamento para identificar novas mutações na resistência a inseticidas ou genes imunológicos de preocupação na saúde pública e no controle de doenças.
Ter soluções acessíveis para sequenciamento de alto rendimento abre portas emocionantes para a genômica populacional e genômica da paisagem destinada a entender a dispersão de mosquitos e o fluxo genético que influencia o sucesso de muitas novas estratégias de controle genético.
