低腫瘍含量組織における腫瘍濃縮のための自動解剖プロトコル

FFPEまたは新鮮な凍結材料からの関心のある小さな分散領域の単離または濃縮は、従来の方法よりも迅速かつ効率的に自動解剖によって達成することができる。FFPEまたは新鮮な凍結組織からのゲノム材料の抽出は、多くの臨床およびトランスレーショナルリサーチラボの要件です。自動解剖は、マクロ解剖とレーザーキャプチャマイクロ解剖の間の大きなギャップを埋める。

まず、ベンダーが提供する表示プラットフォームまたはオープンソースのビューアを使用して、関心のある腫瘍領域のスキャンされたスライド画像に注釈を付けます。デジタルスライドリファレンスを使用する場合、染色されていないサンプル組織スライドをステージ上に第1〜第4スライド位置に置きます。自動組織切除ソフトウェアを使用してフライス加工ジョブを作成するには、[ジョブ] リストを開き、[新しいジョブの作成] を選択し、ケース ID と名前を入力してジョブの名前を入力します。

[厚さ]に移動し、上矢印タブまたは下矢印タブを使用して断面の厚さを選択します。次に、組織調製に移動し、パラフィン処理または脱パラフィン処理を選択します。「参照画像」を選択し、「画像のインポート」を選択します。

次に、ドロップダウンからデジタル参照としてインポートするファイルを選択します。右下隅にある「スキャンステージ」ボタンを選択してステージをスキャンし、第1から第4の位置にある各サンプル組織スライドをキャプチャします。ステージ上の参照の場合は、ボックスをドラッグして組織上に長方形の領域を作成し、長方形の領域の下にある円形のバブルを選択してステージ参照イメージをキャプチャします。

この長方形のフィールドを、参照画像の右上隅にあるコピーオプションを選択して、2番目から4番目のスライド位置にある残りのサンプル組織スライドにコピーします。次に、必要に応じて整列とサイズ変更を行います。デジタル参照画像の場合は、選択した長方形の領域に画像を重ねます。

次に、デジタルリファレンスのサイズを変更して整列させ、もちろんズームして、サンプル組織上のサイズと位置に最も一致するようにします。この長方形のフィールドを、参照画像の右上隅にあるコピーオプションを選択して、2番目から4番目のスライド位置にある残りのサンプル組織スライドにコピーします。次に、必要に応じて整列とサイズ変更を行います。

右下隅にある[スキャンステージ]ボタンを選択して、微調整ステップに進みます。最初のステージ位置を選択し、右側のツールバーにある変形ツールアイコンを選択して、サンプルのスライドオーバーレイに最も合うように参照の微調整とズーム調整を行います。画面下部のサンプルへの参照スライドバーを使用して、参照画像とサンプル画像を切り替えます。

ズームインとズームアウト機能により、各スライド位置のアライメントを調整して実現します。最適なサンプルオーバーレイが得られたら、右側のツールバーのカラーピッカーツールアイコンを選択して、マスクされた参照画像の色付き部分にミリングパスの指定を描画します。ミリングパスをサンプルスライドに描画するには、画面の右下隅にある「注釈を取得」ボタンを選択します。

ミリングパスの計算時に、4 つ以下のミリングチップを持つアノテーション付き関心領域をキャプチャして収集します。左上隅のミリングチップの使用量は、カバーされる面積と選択したチップサイズに基づいて計算されます。チップサイズはミリングチップ矢印の下で変更でき、チップの使用状況が再計算されます。

最初のスライド位置でミリングパスを選択すると、残りのスライド位置にコピーされます。画面の右下隅にある「ステージをセットアップ」ボタンを選択すると、ステージ上の適切な指定で収集チューブからミリングチップがプロンプトでロードされます。リザーバに、組織タイプおよび下流の核酸抽出用の適切な解剖バッファーを3ミリリットル充填する。

次に、画面の右下隅にある[解剖]ボタンを選択します。自動解剖後、収集チューブと解剖したサンプルスライドをステージから取り外します。収集チューブをチューブ・ラックに入れ、スライドをスライド・ラックに入れます。

異種移植片中の転移性結腸直腸癌を含むH&E染色ホルマリン、固定パラフィン包埋、および新鮮な凍結マウス肝臓切片を、スライドイメージャ全体上で20倍の倍率でスキャンし、基準スライドとして使用した。H&E染色された参照スライドに注釈を付け、解剖および核酸抽出のために腫瘍領域をデジタルマスクした。解剖後のサンプルスライドをH&E染色し、10マイクロメートルおよび20マイクロメートルのスライドで解剖領域を確認した。

キャプチャされたメトリックは、自動解剖と核酸抽出の成功を実証しました。このプロトコルを試すときは、染色されていないスライドに比較的正確に注釈を重ね合わせることが、関心のある領域を分離するために重要であることに注意してください。