HIV感染は、検出可能なウイルスのない抗レトロウイルス療法を受けている個人でも免疫機能障害を引き起こす。この方法は、免疫応答の主要な調節因子である単球機能の研究を可能にする。我々は、ヒトの一次単球の単球の単離、培養、トランスフェクションのためにこの技術を最適化しました。
この方法を用い、HIV感染者の免疫機能障害の分子機構を理解しますが、単球を含む他の免疫研究にも応用できます。これが人間の血液を扱う初めての場合は、適切な生体安全プロトコルに従い、すべてのサンプルを感染性物質として扱うことを忘れないでください。4つの10ミリリットルEDTA真空管で40ミリリットルの新鮮なヒト全血を採取した後、無菌技術を使用して、バイオセーフティキャビネット内の単一の50ミリリットルの円錐形プロピレンチューブに血液のすべてを移動させます。
選択したヒト単球分離キットからの製造業者の指示に従って、キットから血液のチューブに2ミリリットルの単球分離カクテルを加え、キットから磁気ビーズを30秒間渦に入れます。血液にビーズを2ミリリットル加え、25ミリリットルの血清ピペットを使用してビーズと血液を慎重に混合します。室温で5分後、4つの50ミリリットルチューブの間で血液を均等に分割し、各チューブに1ミリモルEDTAを加えた30ミリリットルの無菌PBSを加える。
プラスチック25ミリリットル血清ピペットと再び混合し、磁気ホルダーにチューブを置きます。10分後、ピペットを使用して各チューブの中央から内容物を引き出し、1ミリリットル以上の赤血球を吸引せず、チューブの内容物を4つの新しい50ミリリットルチューブの1つに分配します。各チューブに500マイクロリットルのボルテックス磁気ビーズを加え、細胞溶液を穏やかに混合します。
各チューブの中央から新しい50ミリリットルチューブの1つに慎重に内容物を移す前に、チューブを5分間磁気ホルダーに戻します。すべての細胞懸濁液が移された場合、新しい50ミリリットルチューブを磁石ホルダーに5分間入れ、チューブの内容物を新しい50ミリリットルチューブ4個の第3セットに慎重に移します。次いで遠心分離によって細胞を収集し、計数用無菌PBSの合計10ミリリットルで4つの細胞ペレットすべてを再懸濁します。
カウント後、分離した単球を1回10〜37°Cの無血清RPMI 1640培地のミリリットル当たり1回10倍に再懸濁し、再懸濁細胞の1ミリリットルをバイオセーフティキャビネットの35ミリメートルプレートにプレートします。その後、細胞培養インキュベーターにプレートを30〜60分間置き、細胞がウェルボトムに付着できるようにします。M1様表現型のマクロファージのプライムには、各プレートにGM-CSFの1ミリリットル当たり25ナノグラムを含む100マイクロリットルの胎児ウシ血清を加えます。
M2様表現型のマクロファージのプライムには、M-CSFの1ミリリットル当たり50ナノグラムを含む100マイクロリットルの胎児ウシを各プレートに加えます。マイクロRNA模倣、阻害剤、または小さな干渉RNAによる単球トランスフェクションの場合、トランスフェクションキットの製造業者のプロトコルに従い、選択したRNAを10マイクロリットルの希釈模倣または阻害剤の10マイクロリットルで最終濃度1.83マイクロモルに希釈し、5番目の細胞体積に10倍の細胞体積を与えます。トランスフェクション試薬を調製するには、提供されたポリマーの1マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに加え、キット提供バッファーの90マイクロリットルを直ちに添加して、トランスフェクションごとに合計91マイクロリットルの試薬を得る。
摂液を3〜5秒間ボルテックスし、10マイクロリットルの希釈RNAを含むチューブにトランスフェクション溶液のピペット90マイクロリットルを送り込む。穏やかな混合の後、細胞の1つのウェルにトランスフェクション複合体の100マイクロリットルを加える前に室温で15分間溶液をインキュベートする。摂氏37度で4時間後、適切な成長因子を含む完全な培地の3ミリリットルで培地を交換する。
培養の6日目に、M1培養物の培養上清を胎児ウシ血清、抗生物質、リポ多糖類、インターフェロンガンマを添加した3ミリリットルの培地に置き換え、M2培養物の上清をウシ血清、抗生物質、M-CSF、インターロイキン4を補った培地に置き換える。24時間培養した後、活性マクロファージの各プレートを洗浄ごとに新鮮なPBSで2回洗浄する。RNAおよびタンパク質解析では、取り付けた細胞をプレートに直接解凍して、放出された細胞内容物を分析のために収集できるようにします。
フローサイトメトリック解析では、PBSで2ミリモルEDTAの細胞を37°Cで10分間取り外してから、プレート底部から細胞をそっと削り取り、分析のために1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに回収できるようにします。ここでは、非活性化T0細胞と比較してCD163およびCD209の増加レベルを有する、CD80およびCD83およびM2活性化細胞の増加したM1活性化対照および患者由来細胞の代表的なヒストグラムが示されている。興味深いことに、CD80およびCD83は、HIV由来細胞と比較して、コントロール由来細胞でより高く発現しているように見えた。
スクランブル近赤外標識マイクロRNAを用いて採取したばかりのモノサイトのトランスフェクションは、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡で決定されたトランスフェクションの効率が90%を超える結果となります。さらに、トランスフェクションは、細胞成熟の段階またはトランスフェクション条件に関係なく、患者由来または対照細胞の生存率を有意に低下させるものではない。トランスフェクションは、1日目と4日目の分離の両方で特異的な小さな干渉RNAを使用してトランスフェクション時に標的遺伝子の効果的なダウンレギュレーションを生み出します。
さらに、マイクロRNAを模倣してトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクションされていない細胞に対するマイクロRNA発現の48〜72倍の増加を示す一方で、トランスフェクションコントロールの全ては顕著な変化を示さない。メッキされた細胞の数は生存に不可欠です。35ミリメートル皿あたり100万個の細胞をお勧めします。
無血清培地でのめっきも細胞の付着性を大きく向上させます。この方法で得られた細胞は、サイトカインまたは成長因子を用いて、関心のある患者および健康なコントロールの患者における差動応答を研究することができる。
