このプロトコルは、細胞レベルでEVを分析するための堅牢な方法論と、効率的なEV取り込みおよびEV追跡分析のための実用的なアプローチを提供します。EV標識のこの方法は、EVと色素の共沈殿を排除し、EV信号を増強します。EV取り込みは、内部化されたEVと表面的なEVを区別するために、体積解析によって測定されます。
EVは活動的な貨物であり、従って、その取り込みは生化学的分子の移動を可能にする。EVベースの薬物送達とがん治療に関する研究では、この技術を評価ツールにすることができます。EV取り込みは細胞間コミュニケーションの役割を果たし、がん生物学、神経科学、薬物送達など様々な研究分野で研究されています。
このプロトコルは、効率的なEV取り込みアッセイを促進する可能性がある。細胞外小胞(EV)の単離のために、ナノ濾過ベースのマイクロ流体装置のサンプルチャンバーに、前処理された細胞培養培地を1ミリリットル注入する。デバイスを操作するには、ベンチトップ回転機でデバイスを3000 RPMで10分間回転させます。
紡糸後、配管または吸引によって廃液を除去し、次に、細胞培養培地の更に2ミリリットルを処理するためにこの手順を2回繰り返す。次に、分離したEVを洗浄し、PBSを1ミリリットルサンプルチャンバに注入し、ベンチトップスピニングマシンでデバイスを回転させます。EVの免疫蛍光標識の場合、100マイクロリットルの単離されたEVを含むデバイスの溶出穴にEV特異的抗体の1ミリリットル当たり1マイクログラムを注入します。
その後、プレートシェーカーの暗闇の中で1時間インキュベートし、サンプル全体の抗体の均等な分布を確保します。次に、溶出孔に粘着テープを貼り付けます。PBSを1ミリリットルのサンプルチャンバーに注入して残留抗体を洗い流し、サンプルチャンバーが空になるまでデバイスを回転させます。
サンプルチャンバーに別のミリリットルのPBSを注入し、先に示したようにデバイスを回転させて洗浄を繰り返します。チャンバーから残りの液体を取り除いた後、蛍光標識されたEVを膜室から琥珀色のチューブまたはマイクロチューブにピペットします。使用するまで、チューブを光から保護します。
4回10から4番目のPC3細胞を1ミリリットルの培地で35ミリリットル皿に種分します。最適な細胞培養条件で細胞が一晩接着することを可能にする。翌日、付着した細胞をエキソソーム枯渇した培地で2回洗います。
エキソソーム枯渇培地を用いて蛍光標識したEVを適切な濃度に希釈した後、希釈したEVを接着された標的細胞に加え、所望の実験時間にインキュベートする。エキソソームフリー培地で細胞を3回洗浄して非内在性EVを除去した後、CMTMRのミリリットル当たり1マイクログラムで接着した細胞の細胞質にラベルを付け、最適な細胞培養条件でインキュベートする。生細胞イメージングの場合は、準備した細胞をステージ上のインキュベーターに入れる。
制御サンプルに基づいて撮像パラメータを設定した後、ターゲットセルの深さとZ方向の積層サイズの範囲を決定して3D共焦点画像を取得し、画像取得を細胞特異的な色素とEV特異的染料の両方の複数のZスタック画像に同時に設定します。画像処理には、自動画像処理ソフトウェアを利用します。セルの仮想サーフェスを作成するには、[新しいサーフェスを追加] をクリックします。
仮想セルサーフェスを設定するには、[追加]ボタンをクリックし、フィルタタイプとして[品質]を選択します。目視検査による下限の適切な値をしきい値にし、上限の最大値を設定し、[完了]ボタンをクリックして[次へ]をクリックして、EVの仮想ドットを構築し、[新しいスポットを追加]ボタンをクリックします。アルゴリズム設定で、異なるスポットサイズと最短距離計算を選択し、[次へ]をクリックして、ソースチャンネルとしてチャンネル1アレクサFluor 488を選択します。
[スポット検出]で推定 XY 直径に適切な値を入力し、[次へ]をクリックします。仮想 EV ドットを設定するには、[追加] ボタンをクリックし、フィルターの種類として [品質] を選択します。目視検査で下限しきい値を設定し、[スポット領域タイプ] の [次へ] をクリックし、[絶対強度] を選択して、[次へ] をクリックします。
EV ドットの領域をしきい値にするには、目視検査で [領域のしきい値] に適切な値を入力します。[領域ボリューム]の下の直径を選択し、[完了]をクリックします。構築したサーフェス内のグループ化されたスポットを分割するには、[スポットを構築]をクリックして[フィルタ]に移動します。
次に、[追加]ボタンをクリックし、フィルタ タイプとして[サーフェス、サーフェス 1 までの最短距離]を選択します。下限の最低しきい値と上限値の適切な値を設定した後、[セクションの複製]をクリックして新しいスポットボタンをクリックします。セル内の EV の自動カウントの場合は、[作成されたスポット 1] の選択をクリックし、[統計情報] に移動して、[スポットの合計数] から値をエクスポートします。
セルの数を取得するには、[作成サーフェス 1] をクリックし、[統計情報] に移動して[全体]から[サーフェスの総数]の値をエクスポートします。最後に、[統計] の [詳細] タブに移動してボリュームをエクスポートします。ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスを用いてPC3細胞培養培地から分離されたEVを、フルオロ-4-共役EV特異的抗体で標識し、3D共焦点顕微鏡を用いて可視化した。
内部化されたEVは、プンクタとして視覚化され、これらの画像の個別の EV.Post 処理により、細胞内へのEV内在化の可視化と定量が可能になります。EV取り込みアッセイの結果は、EV取り込みのレベルがインキュベーション期間の長さに依存することを示しています。内部化された EV の数を受信者のセル ボリュームに正規化して、指定したセルの EV の実際の取り込み速度を決定できます。
この手順により、非内部化された EV を体系的に除外して、内部化された EV の数を正確に測定できます。内部化されたEVドットのサイズ分布を以下に示します。したがって、重要なステップは、EV標識用マイクロ流体デバイスの利用、蛍光EVの視覚化時のバックグラウンド蛍光の最小化、そして内部化されたEVと表面的なEVを決定するためのポストイメージング分析です。
したがって、細胞内EV追跡は3D平面上でリアルタイムで行うことができるため、空間的/時間的解像度に関するEVの人身売買解析や、細胞内小器官とのEVの共同局在化も可能です。したがって、この技術は、EVの細胞通信分野の研究者に対して、細胞内および細胞外マトリックス内のEVを調査するより簡単で効率的な方法を提供すると考えています。
