The authors would like to thank Christina Ball&#225;zs, Hug Aubin and J&#246;rn H&#252;lsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.

注：この作品で提示実験は、デュッセルドルフ大学の制度的倫理委員会によって承認されている。 1.エキソソーム準備<ol><li>静脈穿刺（9ミリリットルの合計）を介して3クエン酸チューブに全血を収集します。 15ミリリットルファルコンチューブに血液を注ぐ。 </li><li>血漿からの細胞の分離を開始するために、4℃で20分間、1500×gで試料を集める。新しい15ミリリットルファルコンチューブに上清を移し。 </li><li>遠心プラズマからすべての細胞を除去するために4℃で20分間、2800×gで試料（細胞を含まない血漿; CFP）。超遠心分離チューブ、チューブあたり1mlにCFPを転送します。 </li><li>エキソソームを枯渇させる、4℃で90分間100,000×gで遠心し。上清900μlのを削除します。超遠心分離管中の残りの100μlのペレットを再懸濁。 900μlのPBSを追加します。 </li><li> 4℃で30分間100,000×gで再び遠心し。 SU900μlのを削除pernatant。残りの100μlでペレットを再懸濁。 </li><li>転送蒸留水40ml中に再懸濁5〜20μlの。より大きな粒子からエキソソームを分離するために450nmのフィルターを介してサスペンションをフィルタリングします。粒子測定のために、この最終懸濁液を使用してください。 </li></ol>粒子追跡インストゥルメントの2の起動手続き<ol><li>ソフトウェア·アイコンをダブルクリックしてプログラムを起動します。プロトコルを通じてそれらを切り替えるために、様々なソフトウェアのタブ（「セルチェック」、「測定」、「分析」）をクリックします。 </li><li>起動手順の自動化実施のための画面上の指示に従ってください。セル品質チェックとオートアライメントの両方のボックスを選択します。 注：必要に応じてこれらの手順のいずれもが「セルチェック」タブ上のボタン（A）または（B）を押すことにより、別々に繰り返すことができる。 </li><li> NTA器の入口と出口ポートを開いて、10メートルを注入lは、入口ポートを介してセルチャネルシリンジによって水を蒸留した。水の最後の量が注入されているように、出口ポートを閉じます。廃液を収集するために、出口ポートの下にビーカーを置きます。測定セルは、気泡がないことを確認して、システム内に気泡を注射器はありません。すぐに入口ポートを閉じます。 </li><li> 「OK」をクリックすることで、細胞の品質チェックを実行します。ソフトウェアは、数秒後に細胞質の高い結果を表示します。 </li><li>すべての粒子はまだソフトウェアのライブビュー画面内または品質チェックの結果だけ良いか悪い場合を可視化している場合は、残りの粒子が測定セルから削除されるまで、ステップ2.3を繰り返します。また、粒子の蓄積を避けるために、各測定後に、ステップ2.3を繰り返します。蒸留水の注入を繰り返し、セルチェックすると「良い」結果を生成しない場合は、2.9に進みます。 </li><li>均一な200 nmの大きさのPOLを含む制御サスペンションを準備ystyrene粒子は、レーザー顕微鏡の焦点を合わせるために使用する。 600±100粒子は、ライブビュー画面ごとに表示されるように必要な濃度を得るために、蒸留水500mlに、機器の製造元から提供さ懸濁液濃縮物の一滴を加える。 </li><li>ステップ2.3で説明したようにNTAの機器に整列サスペンションを注入。を押して &quot;OK&quot;オートアライメント、システムが自動的に2焦点の最適な位置を見つけるでしょうそれを通して、自動化ルーチンを開始します。 </li><li>プロンプトがシステムを記載した表示されたら、測定を開始するために[OK]をクリックして、今の実験の準備ができている。 </li><li>時折、エタノールの30％溶液で細胞を洗浄することにより、実験間で手動でセルチャネルをきれい。ソフトウェアは自動エラーレポートが表示されたときにチャンネルを清掃してください。 </li></ol>サンプルの3.測定<ol><li> EAの前に蒸留水でチャンネルをフラッシュしますchのサンプル測定（​​ステップ2.3で説明したように）。 </li><li>ステップ2.3で説明したように、チャネルにログイン（セクション1で調製）エキソソームサスペンションを注入。 </li><li>必要に応じてソフトウェアで、次の主なパラメータを調整します。 <ol><li>感度。最適な感度範囲を見つけるために、異なる感度レベル用の画面ごとに測定した粒子の曲線を表示するには、ボタン「感度対粒子の数」をクリックしてください。曲線の最大傾斜の前に感度レベルを選択しました。高感度レベルは、より小さな粒子の可視化を可能にするだけでなく、バ​​ックグラウンドノイズに関連する問題が増加します。 </li><li>最小輝度。フィルタとして、この機能を使用するには、エキソソームの測定のために20の開始明るさを選択しました。ブランクに強く光散乱粒子まで、このパラメータを調節する。アーティファクトを散乱弱く増幅するためにそれを調節する。実験を通して、必要に応じて明るさを変更します。 注：軽粒子スキャッタあまりに強く重なって誤って分析から除外することができる。 </li><li>最小と最大のサイズ。最小および最大の大きさを調整することによって、オーバーサイズの粒子からピクセルノイズや不要な散乱を排除するためにデジタルフィルタを設定する。エキソソームの測定のために10〜500画素の範囲を使用してください。 </li><li>シャッター。カメラは1/300秒に開いている期間を調整します。 </li></ol></li><li>ライブのパラメータを読み出す。 <ol><li> 「ライブ映像」ボタンをクリックして任意の時点で、デジタルとアナログビュー手口を切り替えます。 </li><li>実験を通して、カラーコード化された指標として、試料の飽和状態が表示され散乱強度バーを、監視する。散乱バーが赤の場合エキソソームを分析しないでください。このような場合には、さらに、この現象を回避するために、サンプルを希釈。実験条件は、試料懸濁液の操作を禁止する場合は、感度をダウンレギュレートまたはソフトウェアの明るさをアップレギュレートする測定結果を改善するettings。 注：パーティクルの極めて高濃度のサンプルが分析されている場合、散乱は、個々の粒子を融合し、それらが1つの粒子としてカウントされます。 </li><li>ディスプレイからの視野でカウント粒子の数に注意してください。 </li></ol></li><li> 「測定」タブをクリックします。 </li><li> 「実行オプション」配列内の設定を選択します。 <ol><li>各買収する前に、繰り返しチェック粒子ドリフトテストのための「チェック運動」を選択します。全体の分析を開始する前に、少なくとも1回テストを実行します。ドリフトが20μm/秒よりも高い場合、サンプルが流れて停止するように、測定を継続する前に待機。 </li><li>実験数（5）と、それらの間の時間遅延（0）を選択する。 </li><li>必要に応じて、「サンプルのチェック」を実行します。このテストでは、起動手順におけるオートアライメントの一部であり、必要に応じてその後に繰り返すことができる。 </LI&gt; </ol></li><li>最後に「実行映像取得」ボタンをクリックします。新しいウィンドウに、サイクル数（15）と測定位置（11）の数を定義する。 注：レーザヘッドと顕微鏡11の異なる位置に粒子数を分析するために移動させることができる。実験的な需要に応じて、実験は1つの位置に、または異なる位置で実行する必要があるかどうかを決定する。 <ol><li>粒子がビデオ解像度（低）を設定することにより、1個々の粒子としてカウントされるために追跡する必要がある最小限の時間の長さを確認してください。短い追跡期間中に低い解像度をもたらす。 </li><li>ファイル名を選択し、測定を開始するために「OK」をクリックしてください。 </li></ol></li></ol>結果の解釈4。 <ol><li> 「結果」タブに測定した後に表示された以下の結果とパラメータを表示しますトレースされた粒子の（1）総数、一部の（2）平均数位置、および（3）粒子濃度あたりicles。 <ol><li>数値の粒子数の割合に粒径（直径、面積および容積）の比、ならびに平均および標準分化の値に対する結果の平均表を見る。 </li><li>複数のピークがグラフ解析に存在する場合、ピーク分析表を使用してください。このテーブルには、第一または第二のそれぞれのピークよりも小さい粒子の分布を示している。 </li></ol></li><li>サイズによって粒子の分布を見るために測定し算出グラフを表示します。設定を変更するには、表示モードで、グラフ上のアイコンを使用してください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.+.">Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. .</a> Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037 (2012).</li><li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles.">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li><li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy.">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li><li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes,+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry.">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li><li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Company+profile:+NanoSight:+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology.">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li><li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li></ol>

This work was supported by the institutional funds of the Dept. of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, HHU. The publication costs of this study were provided by Particle MetrixGmbH.

我々は、生体液中のエキソソームのサイズおよび濃度を測定するための新規かつ革新的な方法としては、血液、本ナノ粒子追跡からエキソソームを単離するための詳細なプロトコルを示す。提示された実験では、ヒト末梢血は、エキソソームの起源として使用した。しかし、 など尿、痰、細胞培養上清のような他の起源は、また、試験材料として使用することができる。 ヒトでのエキソソーム濃度の生物学的変動に基づいて、異なる個体からのアッセイは、エキソソームの著しく変動する濃度を特徴とすることができる。しかし、生物学的試験プローブ中の粒子の濃度は、結果に影響を与えることができる。そのため、プローブの希釈用の信頼性と標準化されたアプローチが必要とされている。提示された方法では、エキソソーム含有プラズマは、末梢全血9mlのから生成された。分画遠心法を使用して、エキソソームペレットから単離した手順1ミリリットル血漿懸濁エキソソームの作業サンプルをもたらすように蒸留水5mlに再懸濁した。この事前定義された設定は、NTA時にパーティクルの適切な濃度、 すなわち、適切な散乱強度を私たちに提供してきました。ボリュームおよび希釈側面のほかに、使用されている溶液の組成も重要である。私たちは、エキソソームの最終再懸濁用蒸留水を使用している。もちろん、最終希釈ステップのための異なるメディアはまた実験設定の要件に応じて、使用することができる。緩衝能力を有するサンプルをテストする際しかし、イオン性 - ソリューションのゼータ電位測定の場合には、特に、乱流を含まない条件での慎重な希釈が便利です。複数のサンプルの直接比較のために、我々はすべての試料について同じ希釈レベルを維持することをお勧めします。感度およびビデオ解像度を除くすべての設定はZetaView分析ソフトウェアを使用して後で変更することができる。 10と一緒に行く別の機器設計を提供する他のシステムを採用している。私たちは、結果のサンプルの取り扱いや再現性に関する実用的な側面は、エキソソーム評価のための方法論的順序を選択する際に中心的な重要性であると考えています。我々はまた、理想的な検出システムは、測定の結果を妨げる可能性が、ユーザーによっては要因を排除するべきだと考えています。ここに提示されたエキソソーム解析アプローチは、高度に簡単に取り扱いの基準を満たしている。さらなる利点として、サンプルの半自動解析は短時間で結果を生成する、高速プロセスで行われる。エキソソーム助剤のオンライン可視化GAにアナライザエキソソーム特性、 例えば、総濃度の瞬間アイデアで。 ここに提示さ測定技術に非常にシンプルでありながらエレガントな添加は、抗体標識エキソソームと検出器の前に先行するフィルタを用いて、散乱レーザ光の捕獲を使用することである。このようにして、エキソソームの亜集団は、選択的蛍光染色技術的にアクセス可能なそれらの表面抗原および他の生物学的に関連する特性に応じて区別することができる。 我々の粒子追跡装置の現在のバージョンの1つの欠点は、非常に高い感度レベルでそのようなバックグラウンドノイズなどのアーチファクトは、セルチャネル壁に基づいており、現在になるかもしれないという事実である。現在のシステムへの技術的な解決策と改善は、近い将来に利用可能になることがあります。この方法により、チャネル壁上のレーザ散乱光の反射がそれによって増大する、減少する<html>測定された信号と、得られたデータと検出限界を下げるの精度。 エキソソームの単離のために現在使用されるプロトコルは、十分に確立されて適用される粒子追跡装置は、30nmの低いサイズ分布を有する著しく正確な分解能を有しているが、検出された粒子が実際に完全に真のエキソソームであるという保証はない。そのような死細胞断片またはより大きなタンパク質複合体のような他の粒子は、また、エキソソーム懸濁液中に存在することができ、偽陽性シグナルをもたらし得る。このような「汚染」は、電子顕微鏡（EM）、送信EMや走査EMのいずれであってもよく、除外することが可能な一つの信頼できる方法。以前に提案された表面マーカーの数は、テトラスパニン（TSPAN）、CD81、C63、CD9、 等 11を含む注目の増加量を得ているが、残念ながら、エキソソームのための一般的かつ特異的なマーカーは、これまでに同定されていない。 &quot;&gt;にかかわらず、特にエキソソーム特異的マーカーに関するエキソソーム生物学の研究の将来の進行の、ここに提示されているプロトコルは、エキソソームの単離および検出のための強力な方法を提供する。濃度とサイズを容易にソフトウェア支援で決定することができる簡単なファッション。選択的な蛍光マーカーまたはフルオロフォア結合された抗体の添加は、おそらくさらにNTAの提示手法の適用可能性を高めます。

循環エキソソームの正確な機能は、長期間にわたり未知のままであった。今でもエキソソームの完全パスメカニズムは完全には理解されていない。エキソソームは、起源のそれらの親細胞にそれらを関連付ける抗原、タンパク質及びRNA（mRNAおよびmiRNAの）を運ぶので、細胞 - 細胞シグナル送信機としての機能は、主に優先度が与えられている。 多くの異なる方法がエキソソーム1,2の単離および定量的検出のための文献に記載されている。しかし、「ゴールドスタンダード」に関するコンセンサスに達していない。一方エキソソーム研究の分野で活躍の科学者の大半は分離の一貫した方法は非常に異なったレポートや研究間の比較可能性が高い程度を達成するために保証されることに同意します。 蛍光活性化細胞選別（FACS）は、エキソソーム分析3のための最も一般的で普及しているツールです。 FACSはベンを持って蛍光標識を介して、異なる起源からの細胞を1ステップで比較することができる、efit。 FACSの主な欠点は、さらに少ない彼らのサイズを測定するために、エキソソームは、直径5で30〜120 nmの間で一般的であるのに対し、この方法では、粒子0.5μm未満4を識別するのに十分な感度ではないことである。 走査電子顕微鏡（SEM）および透過型電子顕微鏡（TEM）は、粒子のサイズおよびエキソソームの形態を分析するための他のツールである。しかし、SEMおよびTEMの両方は、サンプルの調製は時間がかかり、両方の方法は、労働集約型の工程を含み、それぞれがアーティファクト世代のいくつかの危険性を有するという欠点を有する。どちらの方法は、1つのサンプルの単一粒子の数千の高いサンプル処理能力および特徴付けに適している。また、サンプルは、多くの場合、非常に短い期間で、同時に、または少なくとも、分析されるている臨床毎日のルーチンの定量分析は、実施が困難。新世代の技術は、今、私たちは前に集中的な準備作業（ 例えば、環境SEM）することなく、エキソソームを分析することができます。これらの近代的な技術はまだそれらの平均数およびサイズ分布6を決定するためにエキソソームを含む大容量の懸濁液を分析するためのかなり不便である。 エキソソームの可視化と分析のためのもう一つの非常に感度の高い方法は、ナノ粒子トラッキング解析（NTA）である。この方法は、物理学の二つの異なる原理を利用しています。まず、粒子がそれらにレーザー光を照射したときの散乱光によって検出される。第2の現象は、それによれば、液体懸濁液中の異なる粒子の拡散が、そのサイズに反比例する、ブラウン運動として知られている。後者の場合、動きは、温度および液体の粘度に依存する。しかし、この速度は、粒子サイズに直接関連し、NTAによって使用される。ソフトの使用ウェアベースの分析、単一粒子からの散乱光のデジタル画像が記録されている。散乱された光スポットのプロットと、その運動速度は、全粒子数及びサイズ分布の決定を容易にするデータを提供する。この技術は、10​​0nm未満の平均直径を有する粒子を分析するために特に強力である。 大きさや濃度測定がZetaViewブラウンと電気モーションビデオ解析マイクロスコープを用いて行われている。これは、液体サンプルのための半自動卓上ナノ粒子分析装置（以下、粒子追跡装置と呼ぶ）である。これは、粒子追跡分析装置およびデータ分析のために使用されるソフトウェアとノートパソコンで構成されている。異種の生物学的試料は、無機粒子のより均一な懸濁液として、この方法に好適である。ビデオカメラとレーザー散乱顕微鏡は、粒子の検出のためとOBSEのために使用されるそれらの動きのrvation。顕微鏡の軸が水平とエキソソームを含有する懸濁液で満たされたセルチャネルに集光されながら、レーザ光が垂直に配向されている。粒子は、レーザー散乱による顕微鏡（ 図1）を介してデジタルビデオカメラ90度で記録された光を照射した。散乱光の強度が大きい粒子直径60nmの観察を可能にする。このような設定において、粒子の明るさは、粒子サイズの唯一の指標ではない。電界無印加時に、粒子の移動は、ブラウン運動に追従し、粒径を算出するための指標として役立ち得る。しかしながら、器具はまた、細胞チャネルにわたって電界を印加することが可能である。このフィールドに曝されたとき、潜在的な、極性および懸濁エキソソームのイオン電荷のレベルは、その移動方向のさらなる決定要因となる。電気泳動MOの速度と方向結果ビリティヒストグラム。 単離されたエキソソームを分析するための最適な方法を見つけることが一つの問題であるが、別のものは、血液、腹水、尿、乳、羊水または細胞培地などの異なるメディアからのエキソソームの有効な分離である。別の方法は、超遠心1（例えばExoquickなど）、工業分離試薬を分離8または限外濾過ステップ9を用いた抗原に対して7、磁性ビーズに基づいている、これまでに記載されている。 このプロトコルでは、超遠心分離を経由してエキソソーム単離のプロセス全体を示し、粒子追跡機器を経由してサスペンションを含む得られたエキソソームを分析する方法を示しています。ヒト血漿または細胞培養培地由来のエキソソームの分析のための具体的な考察が提供される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>364305</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Distilled water</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3880087</td>
			<td>Aqua ad iniectabilia</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td>PP Tube, Steril 15ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifugation tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357448</td>
			<td>Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybead</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>07304</td>
			<td>2,6% Solids-Latex 
			Alignment Solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (Filter)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (ZetaView)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606051V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td>BD Blunt Fill Needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555</td>
			<td>Syringe filter, hydrophilic, 450&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material Name&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>L8-M</td>
			<td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>PMX 100, Type 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Rotor: A-4-44</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative method for exosome quantification and size measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

このデモのために使用したサンプルは、85％の感度、感度曲線の最大傾斜の前に（ 図2）を用いた測定のための最適な設定を示しています。プロトコールで推奨されているように明るさは、最小/最大値が選択された。粒子の平均サイズが、それらのほとんどは0.137ミクロンであった、0.149ミクロンであった5.3×10 6粒子/ mlの濃度を測定した。 測定後に受信した値が.pdfのファイル形式を持つまたはデータベースにエクスポートするための.txtとしてレポートに保存することができます。好ましいものとしてプロトコル（セクション4）に記載のようにグラフを調整することができる。ビデオシーケンスも保存され、後でオフラインで再分析のために使用することができる。しかし、このようなオフライン分析に、カメラの取得前の設定が遡及的に変更することができない。 測定のための最適なパラメータ設定を見つけるために、ここでは目を記述100nmのポリスチレンサイズ標準の例に機器設定の電子の最適化。二つのパラメータ、ビデオ画像及び粒度分布における感度及び最小/最大サイズの影響を詳細に説明する。他のすべてのパラメータを表1にまとめる。 アナログおよびデジタル画像上で（50から94までの範囲）の感度の影響の視覚的印象は、 図3に視覚化される。画像から導出定量的情報は、表1の設定に基づいて、 図4に提示され、最小サイズ=感度対検出された粒子の数を5と最大サイズ= 200の典型的な関係を、 図4Aに示されている。 50と90との間に、検出された粒子の数は、感度を増加し、&gt; 90の感度のために劇的に上昇した。感度の最適範囲は、66と86（A）との間で見出された。のdifで得られた粒子サイズ分布異なる感度の設定は、図4Bに示されている。粒度分布はつの個々の測定値の平均を表す。感度（感度= 62、赤の曲線）が低すぎるために、わずか数粒子はかなり貧弱統計結果を分析した。分析された粒子の数は、感度を増加し、損失正接（曲線）（黄線）70〜86、最適に達した。さらに小さいサイズ（感度= 94、青の曲線）の方にシフト落下粒子サイズ分布の数粒径分布の劣化に対する感受性のリードを高めることができる。 図4Cは、多数のベース×50直 ​​径の傾向（50％を示している粒子は、感受性の関数として）、この直径よりも小さい。ベージュ色の間隔で、粒径のRSDが8％未満であり、Aの最適な間隔に対応する赤色領域悪い統計（低すぎる感度）または広域distriの結果&gt; 8％RSDを示し小さいサイズ（感度が高すぎる）へのシフトとbutions。 最小サイズと最大サイズの設定は、最小サイズよりも小さく、最大サイズよりも大きなスポットサイズの粒子を除去するために、デジタル画像に適用されるフ​​ィルタである。光を散乱させる能力のために、粒子は、デジタル画像上で一定の大きさのスポットを生成する。スポットのサイズは、画素数（ピクセル）として測定される。粒子が非常によく（ 例えば、粒子&gt; 200nm以下の凝集体）の光を散乱する際に、スポットサイズは、 例えば、&gt; 500ピクセル、かなり大きい。スポットサイズは、粒子材料に応じて、小さな粒子（ 例えば、&lt;20 nm）を（ 例えば、&lt;10ピクセル）非常に小さい。それらが同一ではなく、これらの2つの変数の間には直接的な関係がないため、スポットサイズ（ピクセル）の粒子サイズ（ナノメートル）と交換しなくてもよい。最小値と最大サイズの最適化は、ユーザがそのような凝集体（最大サイズ）、小さいなどの不要なオブジェクトをフィルタリングすることができますそのようなバックグラウンドノイズ（最小サイズ）などのオブジェクト。 100 nmのサイズ標準の粒度分布に最小/最大サイズの影響を図4D（感度= 82）に示されている。間隔が小さいスポットサイズ（ 例えば、分= 1、最大= 52;オレンジカーブ）に設定されている場合、分析された粒子の数が減少し、数ベース×50の直径がわずかに小さいサイズの方へシフトする。より大きなスポットの設定（分= 40、最大=千;赤線）ブロードな粒度分布の結果は、より大きなサイズへとシフト。粒子の等しい総数を得るためには、オレンジ色と赤色の両方の分布区間境界は80粒子と一致するように調整した。最適な設定で分布（分= 5、MAX = 200、日焼け曲線）360粒子からなる。 成功した一連の実験は、超遠心分離によって単離したエキソソームを用いて実施して提示システムを用いてNTAによって測定した。結果のデータは非常にあった一貫して再現性の高いレベルを確認した。他の分離方法には、同様の結果を表示する必要があります。しかし、希釈工程は、特に重要なステップであると同定された粒子の計算された総数に及ぼす影響は、再評価されなければならない。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> NTAのセットアップの図1.。顕微鏡/ビデオ軸とレーザビームがセルチャネル断面に交差し、互いに直交するように配向される。粒子によって散乱された光はソフトの「ライブビュー」ウィンドウに表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <stron感度曲線対粒子のG&gt;図2.番号。感度曲線対粒子の数は、自動感度スキャン中に1現時点では1位の粒子が表示されます。このグラフィカルな視覚化は、最初の測定のための最良の好みを決定するために使用される。感度値は、グラフの最大傾斜の前に選択される。これは、成果物がこのテスト実験で除去されないと、グラフに影響を与えることができることを覚えておくことが重要である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> アナログおよびデジタル画像上の感度の図3.インパクト。ライブビュー画面上の粒子の可視化は、アナログ（一番上の行）ANの両方の50と94の間で感度のために表示されているDデジタル（下の行）の景色。感度が低すぎると、ほんの数粒子（左）が検出される。最適な感度で粒子が互いに十分に分離され、単一のドット（中央）として表示されます。比較的高感度で粒子が貧弱な画像品質（右）につながる一緒にマージする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> 感度minおよびコントロール100nmのポリスチレン粒子サンプルの最大サイズの設定を図4に与える影響の粒子の検出数に対する感度（A）のプロット。最適な間隔は、66から86の曲線の最大傾斜前である。 （B）は、複数の感度設定を用いて得られた粒子サイズ分布（62から94）; （62）低すぎるまたは高すぎるためのグラフは、（94）の感度は、100nmのポリスチレン対照サンプルについての粒子サイズ分布を捕捉しない。 （C）感度対数ベースのX50の直径。ベージュ間隔で×50の誤差は8％未満であり、最適な間隔は、66から86の粒度分布における最小の（D）衝撃と最大サイズである。最適なパラメータ（最小= 5およびmax = 200）は、制御サンプルの正しい分布をキャプチャします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 事前取得パラメータ </td></tr><tr><td>感度</td><td>変数</td></tr><tr><td>シャッター</td><td> 40 </td></tr><tr><td>フレームレート</td><td> 30 FPS </td></tr><tr><td>解像度</td><td>ハイガーナ</td></tr><tr><td>サイクル</td><td> 10 </td></tr><tr><td>複数の取得</td><td> 3 </td></tr><tr><td>ポジション</td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> 取得後のパラメータ </td></tr><tr><td>ミン明るさ</td><td> 30 </td></tr><tr><td>最大容量</td><td>変数</td></tr><tr><td>ミンサイズ</td><td>変数</td></tr></tbody></table> 粒子追跡装置の設定の前後の取得パラメータ表1.。

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An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

エキソソームの定量化とサイズの測定のための革新的方法

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.6K ビュー.  Heinrich-Heine-University Dusseldorf. A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

生物学

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

ランダムコニカルチルト方式を使用したエキソソーム複合体の単粒子の電子顕微鏡再構成

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &amp;ldquo;Green&amp;rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

タンジェンシャルフロー限外濾過：コロイダルシルバーナノ粒子の大きさの選択と集中のための &quot;グリーン&quot;メソッド

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

飛行性能の正確かつ迅速な測定のための改善された方法での<em&gt;ショウジョウバエ</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

バレット食道の細胞の特徴のための免疫蛍光法

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. Three-dimensional (3D) cell culture techniques are a recent innovation developed to address the shortcomings of adherent cell culture. While several techniques for generating tissue analogues in vitro have been developed, these methods are frequently complex, expensive to establish, require specialized equipment, and are generally limited by compatibility with only certain cell types. Here, we describe a rapid and flexible protocol for aggregating cells into multicellular 3D spheroids of consistent size that is compatible with growth of a variety of tumor and normal cell lines. We utilize varying concentrations of serum and methyl cellulose (MC) to promote anchorage-independent spheroid generation and prevent the formation of cell monolayers in a highly reproducible manner. Optimal conditions for individual cell lines can be achieved by adjusting MC or serum concentrations in the spheroid formation medium. The 3D spheroids generated can be collected for use in a wide range of applications, including cell signaling or gene expression studies, candidate drug screening, or in the study of cellular processes such as tumor cell invasion and migration. The protocol is also readily adapted to generate clonal spheroids from single cells, and can be adapted to assess anchorage-independent growth and anoikis-resistance. Overall, our protocol provides an easily modifiable method for generating and utilizing 3D cell spheroids in order to recapitulate the 3D microenvironment of tissues and model the in vivo growth of normal and tumor cells.

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

酸性細胞外 pH 培養系の確立

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...