表面プラズモン共鳴分光法は、中程度のスループットの方法でタンパク質リガンドを測定するために確立されています。同じ分子の結合部位変異体に対する異なる親和性、すなわちウイルスに対する鉄結合性の高いマナーオリゴ糖に対する親和性が提示される。SPRは、表面固定化受容体の高分子結合をリアルタイムで研究するためのラベルフリー技術です。
マルチサイト相互作用は、サイズとは無関係に競合結合による速度論的分析で認識されます SPRを使用する研究の特定の領域は、阻害剤または抗体の特性評価を検索するための医薬品開発です。運動定数と親和性は、センサーの応答から直接計算されます。はじめに、100マイクロリットルの溶液をLB-寒天プレートに移し、滅菌セルスプレッダーを使用して穏やかに広げます。
プライマー濃度を一定に保ちながら、5ナノグラムから50ナノグラムの範囲の複数の濃度の二本鎖DNAテンプレートを使用して、一連のサンプル反応を開始します。次に、鉱油オーバーレイの下にDpnI制限酵素を追加し、摂氏37度ですぐに1時間インキュベートして、親スーパーコイル二本鎖DNAを消化します。XL1-Blueスーパーコンピテントセルを解凍するには、セルを事前に冷却された小さな丸い底のチューブに分注します。
次に、各コントロールおよびサンプル反応から1マイクロリットルのDpnI処理された一本鎖DNAを、相補鎖を合成するスーパーコンピテントセルの分離アリコートに移します。形質転換反応を注意深く旋回させて混合した後、氷上で反応を30分間インキュベートします。変態反応に熱パルスを摂氏42度で45秒間印加し、次に反応を氷上に2分間置きます。
次に、0.5ミリリットルのNZY + Brothを加え、225〜250 RPMで1時間振とうしながら、摂氏37度で変換反応をインキュベートします。その後、前に示したように、LBアンピシリン寒天培地上に各形質転換反応の正しい量をプレートします。種培養の場合、少量のアンピシリン含有LB培地に、形質転換プレートからの単一コロニーを接種します。
一晩培養して、10ミリモルの塩化マグネシウム、10ミリモルの硫酸マグネシウム、および20ミリモルのグルコースを含む添加剤を発現培養物に接種し、種培養物を100ずつに希釈する。次に、37°Cで激しく振とうしながら細胞を0.4〜0.6の吸収性600ナノメートルまで増殖させた後、細胞を20°Cに冷却し、1ミリモルのIPTGで誘導して一晩増殖させます。次に、摂氏4度で15分間4, 000 gで遠心分離して細胞を回収し、上清を捨てます。
細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水緩衝液に再懸濁した後、最近4,000gで摂氏4度で15分間避難した。その後、上清をピペットで捨てます。次に、残りのペレットを10ミリリットルの溶解バッファーに再懸濁し、懸濁液を摂氏37度で1時間インキュベートします。
次に、摂氏4度で15分間4, 000 gで遠心分離することにより、可溶性画分と不溶性画分を分離します。さらに、HIS-Select Ni2+アフィニティーゲルを14ミリリットルのチューブに入れて、タグ付き組換えシアノビリン-Nを結合し、それぞれ20ミリモルのイミダゾールと250ミリモルのイミダゾールを含む緩衝液に再懸濁します。これらのステップの間に少なくとも30分間バッチでインキュベートします。
250ミリモルのイミダゾールを含む溶出バッファーを添加してタンパク質を溶出します。タンパク質溶液を10キロのダルトンカットオフフィルターで遠心分離チューブに移し、4、500 g、摂氏4度で10分間遠心分離して濃縮します。SPRランニングバッファーを1〜10の希釈係数に加え、4、500 g、摂氏4度で10分間、初期容量まで4回遠心分離します。
その後、23, 474ダルトンのサイズを示す主要タンパク質CVN2L0について計算された消滅係数に基づいて、NanoDrop UV-可視分光光度計を使用して280ナノメートルでのタンパク質濃度を決定します。デュアルチャンネルSPRシステムの場合、ランニングバッファーとしてHBSCP plusを使用し、再生バッファーとしてpH 1.5〜1.6の10ミリモルグリシン塩酸を使用し、機器のデガッサー、オートサンプラー、ポンプをオンにします。次に、システム全体を二重蒸留水で1時間洗浄します。
次に、検出器に液浸油を滴下し、金薄膜をコーティングしたガラスセンサーチップを取り付けます。そして上側では、カルボキシメチルデキストランヒドロゲルで官能化して、3ポートフローセルの下の検出器に直接配置します。次に、ハンドリングをプルダウンして設定を修正します。
タンパク質性リガンドをセンサーチップに固定化するには、メニューバーのフォームをクリックしてランテーブルを開き、統合されたSPPオートリンクソフトウェアでテーブルエディターを実行します。次に、使用可能な実行テーブルのリストから基本的な固定を選択してクリックし、コンピューター画面で実験手順の手順に従います。次に、フォームセクションのサンプルセットエディターをクリックして、オートサンプラーに配置された2つのラックの試薬リストに記入し、さらに分析します。
メニューバーのツールとしてオートサンプラーダイレクトコントロールをクリックしてラックを前後に移動し、動作温度として摂氏4度を選択します。ツールとポンプの直接制御をクリックして、ポンプを始動して二重蒸留水を注入します。そして、SPR機器の直接制御をクリックしてデータを記録します。
そして毎回、新しく表示されたウィンドウで開始します。カップリング試薬を300マイクロリットルのバイアルに入れた後、オートサンプラーラックに入れ、Runをクリックしてランテーブルを開始します。単純なタンパク質 - タンパク質相互作用のために、毎分25, 000マイクロリットルでポンプを補充した後、30秒間ベースライン調整を行う。
その後、二重蒸留水で1.5分間ベースライン調整してから、活性チップ表面を1モルのエタノールアミン塩酸塩、pH 8.5で急冷します。次に、HBS-EP +フォームをクリックして、液体サンプラーから二重蒸留水からボトルへの脱気装置にチューブを切り替え、下にスクロールして、この操作モードをクリックして後処理に変更します。次に、[追加]をクリックして、各フローセルのデータプラットフォームで時間の経過とともに生成されたバインドカーブを選択し、オーバーレイをスクラバーファイルとしてエクスポートします。
次に、ファイルをクリックしてファイル保存オプションを開き、左右の曲線を揃え、リガンドチャネルの信号から2番目の基準チャネルの信号を差し引くことにより、応答曲線を取得します。CVN2L0と分散V2およびV5の単回注入は、オートサンプラーとランニングテーブルエディターを使用して結合能力を推定するために、血球凝集素結合センサーチップへの結合について最初にテストされました。反復注入は、システム内のナノモルおよびマイクロモル範囲の様々な濃度で経時的に自動化され、チップ表面の飽和も平衡結合も達成されなかったことを実証した。
濃度対応答は、260マイクロモルの解離速度定数を有するより弱い親和性を有するRBD S1サブユニット上のおそらく保存された炭水化物の特異的標的化を仮定して、RBDに結合するCVN野生型についてプロットされた。DMへのCVN2L0-V4結合の同じアフィニティープロットは、小さなグリコシル化ペプチドへの高親和性結合を妨害し、応答最大値よりも高い応答をもたらすジスルフィド結合の置換により、分析できなくなります。SARS-CoV-2上のRBDへのCVN野生型結合は、それぞれ18.6マイクロモルおよび260マイクロモルの解離rage定数を有するSタンパク質およびRBDへの結合を示す。
分析物濃度に対するSPR応答は、CVN野生型およびE41A結合に対する高応答ユニットおよび典型的なSPRセンサーグラムをもたらすが。しかし、変異体は希釈すると不安定です。SPRバイオセンシングは、精製タンパク質とその変異体のリガンドへの高親和性および低親和性結合に取り組んでいます。
我々の場合、センサーチップ表面上の光学的読み出しとデュアルチャネルフローシステムを利用する糖タンパク質。酵素免疫吸着アッセイは、タンパク質エピトープを認識する代替免疫学的方法であるだけでなく、複雑なマトリックスからのペプチドおよび低分子の濃度に関するデータも提供します。SPR結合アッセイによる組換え発現タンパク質の試験には、確認変化のバイオセンシングが組み込まれており、計算タンパク質側によるタンパク質安定性の検証と予測に有用です。
