FASPプロトコルは、強く変性バッファーとの相溶性と、希釈されたタンパク質サンプルに不可欠なフィルターにサンプルを集中させる能力のために、尿プロテオミクスにとって興味深いアプローチです。FASPプロトコルとデータ独立分析質量分析法を組み合わせることで、デジタル直腸検査後に採取された尿であるEPS-尿中の深いプロテオームカバレッジを達成することができます。私たちは現在、前立腺癌に関するバイオマーカー発見の取り組みで見ようとしている方法を適用しています。
手順は、リシア・プレスタジアコモ、パオラ・モレリ、カテリーナ・ガブリエレによって示されます。遠心分離機EPS尿サンプルは、2、100 RCFで室温で10分間採取後2時間以内に行った。その後、使用するまでマイナス80度で上清を保存します。
サンプルを氷の上に、または4度で投げます。手順を加速するには、消化の前日にマイナス80からマイナス20にサンプルを転送することができます。ストックソリューションとして、500ミリモルDTT、10%SDS、pH 8で1モルトリスバッファが必要です。
SDSの67マイクロリットル、DTTの67マイクロリットルおよび33マイクロリットルのTrisの緩衝液の各EPS尿サンプルの500マイクロリットルを薄くする。摂氏95度で10分間、穏やかな揺れでインキュベートします。遠心フィルターユニットを10,000ダルトンの分子量を遮断して組み立てます。
次に、300マイクロリットルの希釈EPS尿サンプルをフィルターに加えます。遠心分離機は約20分間14,000gで行う。ろ過がスムーズに進行しているかどうかを確認するため、15分ほど経過後に一時的に中断することができます。
ソリューション全体がフィルターを通過するまで続行します。その後、14,000 gで200マイクロリットルの尿素バッファーと遠心分離機を15分間加えます。この手順をもう一度繰り返します。
フロースルーがフィルターに触れる間、フロースルーをピペッティングしてコレクションのエッペンドルフを空にします。タンパク質はフィルター上で安全です。システインアルキル化の場合は、使用直前にヨウドアセトアミド溶液を調製する。
数エペンドルフバイアルで約10ミリグラムのヨウドアセトアミドの重量を量り、1mlあたり9.25ミリグラムの濃度、またはモルモル換算で尿素緩衝液に溶解する50ミリモル。各フィルターに50マイクロリットルのヨウアドアセトアミド溶液を加え、6,000 gで遠心分離機を25分間加えます。遠心速度が低いほど、フィルターが乾燥して実行されません。
タンパク質アルキル化後、尿素バッファーと遠心分離機の2つの連続した200マイクロリットルのアリコートを14,000 gで20分間洗浄します。フロースルーを破棄します。20ミリモル3エチルアンモニウム重炭酸塩バッファーと遠心分離機の200マイクロリットルを14,000 gで20分間加えます。
この手順を繰り返します。最後の炭酸水素塩洗浄を完了した後、フィルターユニットを新しい回収チューブに移します。次いで、50ミリモルTEABバッファーの60マイクロリットルを加えます。
トリプシン1マイクロリットル当たり200ナノグラムの濃度でトリプシン溶液を1マイクロリットル加えます。あるいは、エペンドルフ・バイアル内のすべてのサンプルの消化バッファーを準備し、各フィルターに61マイクロリットルの消化バッファーを分配することができます。一晩のインキュベーション中にサンプルの蒸発を避けるために ThermoMixer を使用している場合は、各フィルターユニットをアルミニウム箔の層でラップし、次にパラフィルムの層でラップします。
一晩で37度でサンプルをインキュベートします。翌朝、非常に短いスピンのためにベンチトップ遠心分離機にフィルタを転送します。回転した後、エペンドルフの蓋を開け、140マイクロリットルの水を加えます。
ペプチドを収集するために、バイアルを14,000gで25分間遠心分離する。収集された体積は約190マイクロリットルでなければなりません。SDSの微量を消化から取り除くためには、LC-MS-MSより前のペプチドの強いカチオン交換精製が推奨される。
ピンセットやハサミのような鋭利なツールでエペンドルフの蓋を突き刺してマイクロコラムホルダーを準備します。ホールダーは遠心分離の間マイクロコラムを収容する。準備が面倒なので、ホルダーは複数回利用できます。
鈍い針とを使用して、適切な抽出ディスクのプラークを取り除く。抽出ディスクは、吸着粒子を含む軟質高分子材料である。この場合、吸着剤はカチオン交換性の強い粒子からなされる。
プラークを200マイクロリットルのピペットチップに収容します。ピストンを使用して、先端の端に向かってプラグを押します。小さなディスクはしっかりと押す必要がありますが、過度の強度を避けてください。
チップをホルダーに挿入し、元の蓋を取り外した2ミリリットルのエペンドルフ・バイアルを使用してスピンマイクロカラムを組み立てます。ゲージ16針からのプラグは、約5マイクログラムのペプチドの積載能力を有する。マイクロコラムに2回連続するステーブルを入ります。
適切な速度は、ディスクをピペットチップにどれだけ強く押し込むかによって異なります。毎分20~30マイクロリットルの流量を達成することを目指します。洗浄時やサンプルのロード中にチップを乾燥させないようにしてください。
洗浄液2でサンプルを5倍に希釈し、その結果を溶液に遅い速度でロードします。毎分約15〜20マイクロリットルの流量を目指します。必要に応じて、フロースルーを破棄します。
残留洗剤を洗い流す。次いで、ペプチド溶出前にディスクを乾燥させておく。マイクロカラムをきれいな1.5エペンドルフチューブに移し、すぐに溶出管を加えます。
これは、20%アセトニトリルを含む500ミリモル酢酸アンモニウム溶液の7マイクロリットルになります。有機溶媒の割合を下げるために0.1%のギク酸の27マイクロリットルで溶出液を希釈し、その後得られた溶液の2マイクロリットルをLC-MS-MSに注入し、データ依存モードで検出します。このプロトコルで使用される LC-MS セットアップの詳細については、ビデオの後半で説明します。
データベース検索とペプチド誤差の統合を行った後、全体のピーク面積を計算します。次に、それを外部標準曲線と比較して、FASP消化中のペプチド濃度を推定する。ペプチド量を推定した後、ここで説明するように2つの連続したステージチップ精製によって2マイクログラムのペプチドに対応するFASP消化の新しいアリコートを精製する。
このプロトコルで使用される LC-MS セットアップは、分析列への直接注入に基づいています。トラッピング列を持つシステムを使用している場合は、オフライン C18 精製のステップを避けることができます。各クロマトグラフィー材料に専用の針とピストンを使用することを忘れないでください。
10マイクロリットルの溶離したC18ステージ先端からペプチドを溶出させた後、真空遠心分離機中の溶出物を数分間蒸発させて、完全な蒸発を避けようと試みる。その後、0.1%のギ酸を47マイクロリットル加え、得られた溶液をLc-MS分析用のHPLCバイアルに入れる。ここで使用されるシステムは、トラッピング列を使用せずに列サンプルのロードに基づいています。
分析カラムは、ポリアミドコーティングを除去した後、75マイクロメートルIDキャピラリーを引っ張って社内で作られています。得られた先端はセラミックカッターで優しく形作られてもよい。キャピラリーは、その後、パッキング爆弾に入れられ、C18 3マイクロメートル静止相粒子のmlイソプロパノールスラリーあたり50ミリグラムで梱包されます。
窒素またはヘリウムの10から20の棒の間のガス圧力が必要である。マイクロリットル/分の流量で動作する代替または市販のクロマトグラフィーカラムを使用できます。Tピースにコラムを組み立てます。
他の2つの端は高圧電源およびHPLCループに接続される。アイソクラティックフローでシステムを実行して、最適なスプレー電圧を評価します。次に、分析を開始します。
表示されるように2時間の長いクロマトグラフィー勾配にわたってペプチドを分離します。データ取得は、迅速な完全な MS サービス スキャンの後に可変幅の前駆体ウィンドウで 26 MS-MS スキャンで構成されます。20 m/z 幅から始まり、350 ~ 750 トンプソンの m/z 範囲をカバーする最初の 20 のウィンドウ。
次の 5 つのウィンドウの 50 m/z 幅に移動し、1 つの MS-MS スキャンで終わり、分離幅は 200 Thompson です。狭い幅は、ペプチド前駆体の存在の面でスペクトルのより人口の多い領域を占める。DIA 解析にはスペクトルライブラリが必要です。
スペクトルライブラリを生成するために、同じクロマトグラフィー勾配を使用してDIAの取得に使用していたのと同じLC-MS-MSシステム上でいくつかのデータ依存実験を行うことができます。サンプル分画はプロテオームの被覆率を増加させます。ステージのヒントは、サンプルの分数に使用できます。
強いカチネーション交換と基本的な逆相は、2つの有効な選択肢です。いくつかのFASPダイジェストのプールの10マイクログラムから始めます。0.2%TFA最終濃度を使用してサンプルを酸性化します。
高容量C18ステージのヒントにペプチドをロードします。ペプチド量が多い場合は複数のディスクを使用してください。10マイクログラムの材料の場合は、2枚のディスクが推奨されます。
先に説明したようにC18精製を行う。溶出コレクションのためにいくつかのバイアルを準備します。分数の数と同じ数。
この場合、10分の一部が段階的な溶出によって生成される。最後の洗浄後、最初の溶出物を20マイクロリットル加えます。0.2%水酸化アンモニウム、10ミリモルTEAB、4%アセトニトリル。
最初のエッペンドルフの最初の分数を完全に溶け出した後、ステージの先端を次のコレクションバイアルに移動します。溶出液として用いた20マイクロリットルのステップで希釈し、水酸化アンモニウムの0.2%、10ミリモルTEAB、そしてアセトニトリルの量を増加させる。サンプルを分数し、各分数に関するデータ依存実験を実行した後、MS-MSデータのデータベース検索によってスペクトルライブラリを生成します。
その後、少なくとも3つの遷移によって割り当てられた1つのユニークなペプチドの最小値に基づいて、タンパク質定量のためのDIAデータ分析が可能なソフトウェアにライブラリがインポートされます。尿プロテオームの広い範囲をカバーすることを期待しています。この図は、5桁に及ぶ豊富な範囲にわたるタンパク質の同定と定量を示しています。
ここで提示されたワークフローは、濃度の優位性とFASPプロトコルの汎用性とDIAスキャンモードの感度を組み合わせたものです。この組み合わせは、尿プロテオームの豊富な地図を提供します。当社の分析設定にはトラッピングカラムの使用が含まれていないため、FASPダイジェストは強いカチオン交換と逆相ステージのヒントの両方によって精製されました。
トラップ列が分析列に直接接続されている場合、逆フェーズステージヒントステップを省略できます。このワークフローの使用はEPS尿サンプルを分析するために推奨されるが、それは使用は一般的に尿プロテオミクスに拡張することができる。
