マルチカラムプレートアダプタを使用した経済的で多用途の高スループットタンパク精製システム。こんにちは、タンパク質の構造と機能の研究にはタンパク質精製が不可欠です。そして、それは通常、生物物理学的技術と組み合わせて使用されます。
これは、高スループットタンパク質の生産を必要とする機能プロテオミクスの時代に特に重要です。我々は、マルチカラムプレートアダプターであるMCPAが、並列精製のためにマルチウェルプレートと異なる樹脂の複数のクロマトグラフィーカラムをインターフェースすることができると仮定した。このアダプターを使用して、我々は自動化システムの速度で重力または真空のライバルの下で使用することができるタンパク質浄化の経済的で、汎用性の高い方法を開発しました。
ここでは、ニッケル親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーに関するこの方法を示す。穿刺されたシールマットを長いドリッププレートに置いてMCPAを組み立て、シーリングマットの穴に所望の列数を挿入します。マニホールドの基部に開いたコレクションプレートを置き、マニホールドの上部で閉じます。
チューブを取り付け、上部に柱を持つ組み立てられた MCPA を配置します。ニッケルNTA溶液のピペット1.2ミルを柱に入れます。ピペットしながら、ビーズが完全に混合されたままであることを確認してください。
ポンプのスイッチを入れ、20%エタノールをカラムから下のコレクションプレートに流します。液体が通ったらポンプをオフにします。回収板の中身をゴミ箱に入れなさい。
すべての列にEDTAバッファーの3つの樹脂ボリュームを追加します。ポンプの電源を入れ、液体を通します。今0.5モル水酸化ナトリウムバッファーの3つの樹脂ボリュームでカラムを洗浄します。
100ミリモルニッケル硫酸の4つの樹脂容積、ミリQ水の10樹脂ボリュームでカラムを洗浄します。カラムの動作が遅い場合は、シリンジプランジャーで液体を押し通します。回収プレートの中身をゴミ箱に注ぎます。
その後、10ミリモルイミダゾール洗浄バッファーの4つの樹脂ボリュームでカラムを2回洗浄し、コレクションプレートを空にします。複数のサンプルを精製する場合は、開いた回収プレートを48ウェルプレートに交換します。真空をオフにして、ライセートをカラムにロードします。
薄いプラスチック製のスターラーを使用して、ビーズとライゼを列内に穏やかに混ぜて結合を最大化します。ポンプの電源を入れ、液体を通します。カラムがブロックされた場合は、新しいフィルターを使用して、ライセート樹脂混合物をカラムに移します。
フロースルーを含めるには、コレクションプレートをフリーズします。開いたコレクションプレートに交換し、10ミリモルイミダゾール洗浄バッファーの9樹脂ボリュームでカラムを洗浄します。この手順を 4 回または 5 回繰り返します。
オーバーフローを避けるために、定期的に廃棄物プレートを空にします。開いたコレクションプレートを96ウェルプレートに置き換え、A1が左上隅に表示されていることを確認します。変性溶出バッファーの樹脂体積を柱にピペットする。
液体を通して、井戸間に汚染がないことを確認するために回収板を点検しなさい。次の希釈のために、前のステップを繰り返し、新鮮なコレクションプレートに集めます。純度および濃度分析のために各溶出の50マイクロリットルのアリコートを取る。
次に、20%エタノールの2ミリリットルでカラムを洗浄します。20%エタノールの別の2ミルを列に加え、新鮮な薄いプラスチックスターラーを使用してエタノール中のビーズを混ぜ合わせ、摂氏4度で貯蔵するために50milチューブに移します。すべての柱にオープンコレクションプレートと注射器プランジャーを使用して、MCPAを真空マニホールドで組み立てます。
前列からすべての注射器のプランジャーを取り外します。5ミルシリンジプランジャーからゴム製ガスケットを取り出し、中央に穴を開けます。次に、開いた柱の底部を穿刺されたゴム製ガスケットを通して押します。
これらの手順を繰り返し、列の最前列に挿入します。Qセファロースビーズが完全に混合されていることを確認します。そして、下から2センチメートルカットされた青いピペットチップで、Qセファローズビーズの800マイクロリットルを開いた柱にピペットします。
ビーズがカラムの底に落ち着いたら、20%エタノールを通して実行するのに十分な真空ポンプをオンにします。10ミリモルトリスの2ミルで列を2回洗います。トリスバッファーが通る直前にポンプをオフにして、樹脂が乾燥するのを防ぎます。
流出は廃棄され、48ウェルのコレクションプレートに置き換えることができます。精製するすべてのサンプルを最初の行のQセファローズ列に移し、薄いプラスチックスターラーを使用してサンプルとビーズを約2分間混合してから真空ポンプをオンにします。後で分析するためにフロースルーを保存またはフリーズします。
オープンコレクションプレートで、10ミリモルトリスの2ミルでカラムを2回洗います。開いたコレクションプレートを96ウェルプレートに交換します。最初の溶出分数は、最初の行または2番目の行に集めることができます。
2列目に溶け出すために、これらの位置から注射器のプランジャーを取り外します。Q セファローズ列をこれらの位置に移動し、最初の行の開いた列にシリンジ のプランジャーを配置します。第1塩濃度の1ミリリットルをQセファローズ列にピペットする。
ポンプの電源を入れ、溶出を収集します。次の溶出を収集するには、次の位置から注射器のプランジャーを取り外し、Qセファローズ列をこれらの位置に移動し、前の位置のプランジャーを交換します。溶出に使用される連続した塩濃度ごとにこれらのステップを繰り返します。
4 つの溶出ごとに新しいコレクション プレートが使用され、すべてのプレートにラベルが付いて保存されていることを確認します。オープンコレクションプレートで、4つのモル塩化ナトリウム、10ミリモルトリスの2ミルで柱を洗います。20%エタノールの2ミルをピレットし、ビーズのすぐ上になるまでこれを実行し、保管のために列を密封します。
一例として、MCPAはニッケルNTAによる変性条件下での14個のAbpSH3変異体の精製に成功した。タンパク質はまだ大部分が純粋であるが、小さな汚染物質は25キロダルトンで見ることができます。変性条件で見られる小さな汚染物質は、ネイティブ条件で除去されます。
これは、11種類のSH3ドメインを精製した際に示した。これは、MCPAが精製条件の比較に使用できることを示しています。AbpSH3は、イオン交換精製を介して、大部分の汚染物質から、分解物から分離することができる。
かなり純粋なAbpSH3タンパク質の良好な収率は、種々のより高い分子量の汚染物質で回収された。MCPAとのイオン交換を用いたニッケル-NTA後の試料の精製は、これらの高重量汚染物質を正常に除去しました。まだわずかな汚染がありますが、分画はまだ大部分が純粋であり、NMRと熱化学的変性アッセイを使用して良好な生物物理学データを生み出しています。
結論として、我々の仮説は正しく、MCPAは異なるクロマトグラフィー技術を用いてミリグラム量のタンパク質を正常に精製できることを示している。MCPA システムは、同じ実行内で複数の方法で構成して、精製条件を最適化することができます。セットアップは、特に日常的にタンパク質を精製しないラボでは、シンプルで安価で、経験の浅いユーザーを訓練するのは簡単です。
