実験の全体的な目標は、クロマチンの状態を反映したゲノム全体のタンパク質関連DNA断片を同定することでした。この目標を達成するために、3つの特別な操作が行われました。まず、植物細胞から無傷の核を単離した。
第二に、クロマチンへの修飾は、その場で特定の抗体によって認識された。第三に、プロテインA-トランスポザーゼ融合タンパク質であるTn5トランスポザーゼを連結する抗体は、マグネシウムイオンの活性化下でその場でクロマチンを切断する。次いで、DNA断片およびクロマチン修飾結合部位をアダプターと統合し、DNA調製の準備を整えた。
ポリメラーゼ連鎖反応濃縮増強生成シーケンシング。DNAおよびヒストン修飾、転写因子の挙動、およびそれらのリクルートされたタンパク質を有する非コードRNAを含む、色レベルでのエピゲノミクス調節は、遺伝子発現の時間的および空間的制御をもたらす。Henikoff Labが開発したCUT&Tag技術は、クロマチンエピゲノミクスプロファイリングを高効率で行うための酵素テザリング法です。
ここでは、実験材料として綿葉を採用し、一例としてヒストンH3リジン-4トリメチル化の抗体を用いてクロマチンプロファイリングを行った。私たちは、プラントでのCUT&Tagパフォーマンスのためのビデオで洗練されたプロトコルを提供しています。CUT&Tagを用いた各サンプル調製について、綿葉組織グラムを採取した。
葉を液体窒素で微粉末に粉砕し、25mLの冷却核隔離緩衝液A.The緩衝液を入れた50mLファルコンチューブに移し、緩衝液を穏やかに混合し、チューブを氷上で5分間穏やかに振とうして材料を均一に分散させた。次いで、500相対遠心力またはrcfで、摂氏4度で、5分間スピンし、細胞ペレットを形成した。上清をデカントし、ペレットを20mLの冷却核分離緩衝液Bで再懸濁し、0.5%Tritonを補充した。
チューブを穏やかに反転させ、ペレットを完全に再懸濁させた。次いで、得られた細胞溶解物を2つの篩の組み合わせで濾過し、500メッシュの篩を上に用いて、より大きな組織破片を除去した。そして底に1000メッシュの篩を用いて核を回収した。
ふるいの適切なメッシュサイズの選択は、植物の核のサイズに依存する。滅菌ろ紙を篩の裏側に使用して、溶解物および小細胞破片の一部を吸収させた。核を含む溶解液を新鮮な1.5ミリリットルの遠沈管に移し、300rcfで4分間、摂氏4度で紡糸して核を回収した。
遠心分離後、ピペットチップを使用して、できるだけ多くの上清を除去した。800マイクロリットルの量で、核洗浄緩衝液を加えた。そしてチューブを穏やかに反転させ、核を再懸濁させた。
チューブを300 rcfで再び回転させ、摂氏4度で4分間回転させた。合計3回の洗浄の後、得られた核を新鮮な1.5ミリリットルの遠沈管で合わせ、摂氏4度で4分間、300rcfで回転させた。ピペットチップを使用して、残りのバッファーをできるだけ多く除去しました。
次のステップは、抗体のインキュベーションであった。50マイクロリットルの核のアリコートを、ジギトニン中のEDTA、BSA、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した1ミリリットルの抗体緩衝液に再懸濁した。150マイクロリットルの核懸濁液のアリコートを、1回の反応のために新鮮な1.5ミリリットルのチューブに入れ、2マイクロリットルの抗体を各チューブに添加した。
このアッセイでは、抗ヒストン−H3−リジン−4−トリメチル化抗体および免疫グロブリンG陰性対照群についての2つの生物学的複製を、抗体添加後にセットアップした。溶液を穏やかに混合し、チューブを水平シェーカー上に放置し、12rpmで摂氏4度で一晩ハイブリダイゼーションさせた。翌朝、チューブを取り出し、800マイクロリットルの免疫沈降洗浄緩衝液を用いて核を洗浄した。
チューブを穏やかに反転させて混合し、水平シェーカー上に室温で12rpmで5分間放置した。洗浄後、チューブを摂氏4度で4分間、300rcfで回転させた。遠心分離後、上清をピペットチップを用いて除去した。
これを合計3回の洗浄で繰り返した。3回目の洗浄後、チューブを摂氏4度で2分間300 rcf回転させ、ピペットチップを使用して残りのバッファーを可能な限り除去しました。インキュベーションのためにTn5トランスポザーゼミックスを調製した。
1マイクロリットルのトランスポザーゼを、各150マイクロリットルのトランスポザーゼインキュベーション緩衝液に添加した。反応回数に応じて、まずトランスポザーゼ溶液ミックスを調製することをお勧めします。次いで、各チューブに150マイクロリットルのアリコートを加えた。
溶液を穏やかに混合し、室温で12rpmで水平振とう機上に2時間放置した。チューブを10〜15分ごとに穏やかに混合した。インキュベーション後、室温で800マイクロリットルの免疫沈降洗浄バッファーを用いて核を3回洗浄し、未結合のTn5トランスポザーゼを除去した。
3回目の洗浄後、チューブを摂氏4度で2分間300 rcfで回転させ、ピペットチップを使用して残りのバッファーを除去しました。タグ付け工程のために、300マイクロリットルのタグ付け緩衝液を反応管に添加した。溶液をよく混合し、摂氏37度で1時間インキュベートした。
10マイクロリットルの10マイクロリットルの10マイクロリットルのEDTAを30マイクロリットルの10%SDSでインキュベートした後、反応を決定した。次に300マイクロリットルのDNA抽出緩衝液を加えた。不規則なDNA抽出を行った。
DNA断片を25マイクロリットルの滅菌水に溶解した。24マイクロリットルをNGSライブラリー構築におけるPCR増幅に使用した。この図は、DAPIによる無傷の核染色を画像化し、顕微鏡下で十分な量の無傷で比較的きれいな核を得ることがCUT&Tagにとって重要なステップであることを示しています。
PCR後、2マイクロリットルを移入し、DNAのサイズを1.5%アガロースゲル上でチェックした。この図は、ネガティブコントロールの免疫グロブリン遺伝子と比較することを示している。ヒストンH3リジン4トリメチル化サンプルからのDNA断片の大部分は、280〜500塩基対の範囲であるべきである。
DNA断片を精製し、ハイスループットシーケンシングによってプロファイリングすることができます。この図は、抗ヒストンH3リジン4トリメチル化抗体についての生成シークエンシングを免疫グロブリンG陰性対照群と比較した結果を示す。この技術は、ChIP-seqと比較して、手順が簡素化された少数の細胞を使用して、高解像度で非常に低いバックグラウンドでDNAライブラリを生成します。
CUT&Tagは新しい方法であり、まだ進行中です。
