プロトコルは人間のpre-implantation胚の非侵襲的な染色体スクリーニングNICSに基づいて培養された媒体のコレクションおよび染色体の倍数性の分析を正常化することである。NICSの主な利点は、TiDieRマイクロマニピュレーションよりも操作が簡単で、時間を節約でき、侵襲的な生検サンプルの損失を効果的に減らすことです。サンプリング方法は非常に柔軟です。
ここでは、ルーチンの連続胚培養用と1ステップ用の2つの異なるオプションを提供しています。Yaxin Yao博士とXiaohui Zhu博士は、主にライブラリの準備とNICS再生シーケンシングを担当しています。Jialin Jia博士と私は、発生学の作業とサンプル収集を完了しました。
劉教授は私たちのグループのリーダーです。彼女はこの記事の責任著者でもあります。まず、試薬とツールを準備します。
使用前に20〜30マイクロリットルの培地とヒアルロニダーゼを予温し、平衡化します。次に、培地とヒアルロニダーゼをドラフトの作業台に置きます。消化したOCCCを培養皿に迅速に移し、卵母細胞を処理し、各ウェルで鉱油で覆います。
卵母細胞を5〜10回穏やかに吸引して放出し、卵母細胞の周囲に残っている顆粒膜細胞を取り除きます。残りの3つのウェルでこの手順を繰り返して、顆粒膜細胞を完全に除去します。顕微鏡を使用して顆粒膜細胞除去の完全性を評価します。
次に、ICSIとも呼ばれる細胞質内精子注入を行い、胚を培地に移します。胚ごとに20〜30マイクロリットルの胚盤胞培養培地の微小液滴を準備します。2日目に組織培養皿で胚を鉱物油で覆い、摂氏37度、5%の二酸化炭素と5%の酸素でインキュベートします。
3日目の胚を洗浄用微小液滴に移した後、ピペットを用いて3滴の微小液滴中の胚を静かに吸引し、放出する。次に、胚を胚盤胞培養液に移します。洗浄用微小液滴を調製し、微小液滴を培養します。
4日目の午後に、胚をあらかじめ温めた培地の微小液滴に移し、ピペットで各胚を3つの微小液滴で静かに連続して洗浄します。各胚を、サンプル採取のために、事前に温められた単一の培養液滴に移します。凍結保存の前に胚盤胞胚を培養します。
胚凍結保存前にガラス化を行うには、培養マイクロドロップレットを調製し、胚を10〜15マイクロリットルの培養培地の予め加熱されたマイクロドロップレットに移します。そして、5日目の朝にピペッティングにより、各胚を3つの微小液滴で連続的に静かに洗浄します。前述したように、各胚を、サンプル採取のために、事前に温めておいた培地の単一の微小液滴に移します。
そして、凍結保存する前に、胚盤胞胚を摂氏37度、二酸化炭素5%で培養します。次に、栄養外胚葉の細胞接合部に焦点を合わせたレーザービームのターゲットポイントからかなりの距離でICMを静かに調整し、栄養外胚葉に小さな穴を開けて胚盤胞腔から液体を放出します。サンプルを採取するには、キット内のバッファーを室温で解凍し、短時間遠心分離します。
次に、培養した各胚から培地を、5マイクロリットルの細胞溶解バッファーを含むRNase-DNaseフリーPCRチューブに移します。試薬とツールを準備します。ゲノムDNAを定量した後、培養液で50ピコグラム/マイクロリットルの濃度に希釈した。
十分に混合した後、チューブを200 Gで5秒間短時間遠心分離します。培養液を微量遠心分離機で30〜60秒間遠心分離した後、チューブの底部から10マイクロリットルの培地をピペットで移し、ポジティブコントロールと新鮮な培養液を新しい0.2ミリリットルのPCRチューブに入れました。1マイクロリットルのMT酵素ミックスを加え、ピペッティングで完全に混合します。
その後、すぐに2〜3秒間遠心分離します。PCRチューブを予熱した混合サンプル調製ステーションに入れ、溶解プログラムを実行します。pre-libの緩衝液が解凍され、混合されたら、200 G.Prepareで2から3秒の間それを60マイクロリットルのpre-libraryの緩衝液にpre-libraryの酵素の組合せの2マイクロリットルを加えることによってpre-libraryの反作用のためのマスターの組合せをすぐに遠心分離機にかける。
反応液を十分に混合し、短時間遠心分離します。前処理した培地サンプルに60マイクロリットルのプレライブラリ反応ミックスを加えます。ピペッティングで完全に混合した後、すぐに200Gで2〜3秒間遠心分離し、PCRチューブを予熱したサンプル調製ステーションに入れます。
ライブラリー前プログラムを実行し、摂氏 4 度に保持します。60マイクロリットルのライブラリーバッファーに1.6マイクロリットルのライブラリー酵素ミックスを添加して、ライブラリー反応用のマスターミックスを調製します。反応液を十分に混合し、前述したように遠心分離します。
60 μL のライブラリ反応混合物と 2 μL のバーコードプライマーを各プレライブラリ製品に添加します。次に、反応液を完全に混合し、実証したように遠心分離します。遠心分離後、PCRチューブをサーマルサイクラーに入れます。
ライブラリ準備プログラムを実行し、摂氏 4 度に保ちます。試薬とツールを準備します。調製した1Xメガビーズをライブラリサンプルに加えます。
テキスト原稿に記載されているように精製されたライブラリを定量し、各ライブラリサンプルの10ナノグラムをプーリングに使用します。シーケンシングユーザーガイドを参照し、シーケンシング完了後にデータ解析を行ってください。ChromGoでデータ分析を行うためのログインページで、ユーザー名とパスワードを入力します。
ログインしたら、[NICS]タブの[提出書類の作成]をクリックします。次に、プラットフォームにNGS、CorporationにIllumina、試薬にNICSInstを選択します。[プロジェクト ID] の下のボックスにプロジェクト情報を入力します。解析のプリファレンスを設定し、ファイルをアップロードします。
すべてのシーケンシングファイルが正常にアップロードされたら、[送信]をクリックして解析を開始します。提出されたプロジェクトは、[提出物の表示]タブに一覧表示されます。[Report] フィールドの [Show] ボタンをクリックして、NICS 分析の概要テーブルを表示します。
[レポートのエクスポート(Export Report)] ボタンをクリックして、レポートを保存します。患者から6個の胚盤胞を採取し、4日目から5日目の培地まで6個の胚すべてに対してNICSを実施した。両親の平衡転座による染色体異常は、NICSアッセイを用いて5本の染色体で検出されたため、移植には使用しなかった。
2つの胚のNICSの結果は、同じ核型45 XNと染色体18の欠失が両方とも18番染色体欠失であることを示しました。核型46 XN短腕一染色体領域欠失は、染色体領域欠失の短腕のみであった。NICSの結果、核型46 XNは、18番染色体領域欠失の長腕と1番染色体領域重複の短腕を有することが示された。
核型は5番染色体重複であり、8つのモザイク差異が見られたが、NICSアッセイは24染色体すべての異数性をスクリーニングできた。このプロセスは、単一の正常な核型胚盤胞を移植するための新しい方法を提供します。この手順を試みている間は、母体由来の汚染を避けるために精卵細胞を完全に除去し、DNA含有量が増幅に十分であるときに培地と説明された胚盤胞段階を収集することを忘れないでください。
NICS技術を使用することにより、本研究では、WGAおよびWGSライブラリの準備手順を約3時間で合理化し、CCS結果を約9時間で非侵襲的にオプトインしました。その開発後、この技術はARTの臨床医に、形態学的評価とNICSを組み合わせて、形態が良好な一倍体胚を子宮に移植する新しい方法を提供しました 進行中の妊娠率と出生率を改善する可能性があります。
