このプロトコルにより、研究、分子欠損および免疫学的欠損のために、疾患を有する患者からリンパ球T細胞を単離する能力が可能になる。この方法により、これらの患者からRNA、DNA、タンパク質を精製するために、生存細胞、疾患異常を有する細胞を単離することができ、分子欠陥を特徴付けて、病因に重要な経路異常を理解することができる。この方法は、正常状態の血球、ならびに免疫異常を有する疾患からの血球を研究するためにさらに分画することができる末梢血の単離に有用である。
この手順を実演するのは、私の研究室の医学生研究員であるAlannaです。抗凝固剤を含む5本の10ミリリットルチューブで末梢血サンプルを得た後、被験者番号でラベル付けされた50ミリリットルの分離チューブに10〜15ミリリットルの血液を移し、サンプルを少なくとも2倍に希釈するが、HBSSでチューブあたり35ミリリットル以下とする。チューブあたり約13ミリリットルの密度媒体で血液を慎重にゆっくりと下敷きにし、泡を防ぐためにピペットがほとんど空になったらピペッティングを停止します。
血液と密度媒体層が混ざらないようにピペットをゆっくりと取り外し、充填した分離チューブを層を乱すことなく慎重に遠心分離機に移します。遠心分離によって細胞を分離した後、上層を含む血漿の最後の10ミリリットルを除くすべてを除去してから、バフィーコートを注意深くゆっくりと回収する。2つの分離チューブの間からバフィーコートを単一のラベル付き滅菌50ミリリットルチューブにプールし、PBMCを新鮮なHBSSで少なくとも2倍に希釈して、チューブあたり合計50ミリリットルにします。
すべてのバフィーコートが収集されたら、遠心分離によって細胞をペレット化し、各チューブからできるだけ多くの上清を除去する。チューブの底部をタップしてペレットを緩め、チューブあたり元の10ミリリットルの血液サンプル量あたり1〜2ミリリットルのACK溶解バッファーにペレットを再懸濁します。正確に5分後、等容量以上のHBSSで各チューブの溶解を停止し、各容量を50ミリリットルに調整する。
遠心分離後、上清を捨て、同じドナーから細胞をプールし、別の遠心分離のために新鮮なHBSSで最大50ミリリットルの容量をもたらす。次いで、計数のために細胞を10ミリリットルの摂氏37度RP 10F培地に再懸濁する。CD4+CD45RO+T細胞精製のために、細胞をスピンダウンし、PBMCを選択緩衝液濃度のミリリットル当たり10〜7番目の細胞の5倍に希釈する。
細胞を5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブに移し、穏やかに混合しながらサンプル1ミリリットルあたり50マイクロリットルの抗体カクテルを加える。室温で5分後、渦磁性粒子を30秒間高速で加速し、その後、穏やかに混合しながらチューブに試料1ミリリットルあたり50マイクロリットルの磁性粒子を加える。新鮮な選択バッファーと穏やかな混合で容量を2.5ミリリットルにし、チューブを磁石の上に2.5分間置きます。
インキュベーションの最後に、磁石を拾い上げ、チューブを1つの連続運動で反転させて、濃縮細胞懸濁液を新しい滅菌チューブにデカントする。細胞回収率を高めるには、固定化ビーズを邪魔することなくチューブに2.5ミリリットルの選択バッファーを加え、磁石上でさらに2.5分間インキュベーションし、洗浄液を収集チューブに追加し、血球計数器を使用して生細胞数をカウントし、フローサイトメトリーによって細胞純度を確認します。細胞を活性化するには、CD4+CD45RO+T細胞を37°CのRP 10F培地濃度のミリリットル当たり10~6個目の細胞の5倍になるように調整し、適切な大きさの培養皿に細胞を播種する。
加湿された摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターで細胞を一晩休ませる。翌朝、遠心分離により休止細胞を回収し、37°C摂氏RP 10F培地濃度の1ミリリットル当たり10~6個目の細胞を5回10~5回でペレットを再懸濁した。懸濁液を3つの滅菌スクリューキャップチューブのそれぞれで5〜10回10〜6個の細胞アリコートに分割し、チューブ2の細胞をPMAで、チューブ3をA23187で刺激し、穏やかに混合する。
等量のジメチルスルホキシドを第1のチューブに加えてビヒクルコントロールとして機能し、キャップを緩めたチューブを適切な活性化期間の間インキュベーターに入れます。インキュベーションの最後に、遠心分離によって細胞を収集し、細胞ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上清を捨てる。次いで、市販のRNA単離キットの指示に従って細胞を溶解し、製造業者の指示に従ってRNAを単離する。
このネガティブ選択プロトコルによって得られたCD4 + CD45RO + T細胞の生存率および純度は一貫して高い。SS PBMCsからの白血還元系チャンバーから得られたCD4+CD45RO+T細胞の収量は、正常ドナーPBMCsから約16%と比較して典型的には約75%である。 SSメモリーT細胞およびSS PBMCは、正常なドナーT細胞およびPBMCからの細胞と比較して、サイトカインおよび他の免疫応答遺伝子の発現が乏しい。
さらに、正常なドナーT細胞では通常発現しない多くの遺伝子は、静置時および刺激後の両方でSS T細胞において高発現される。優れた滅菌技術と一貫したルーチンは、この技術の成功にとって非常に重要です。また、Ficollを重ねている間は、細かいコントロールを備えた自動ピペットを使用し、Ficollを敷設する速度に本当に注意を払うことも非常に重要です。
この方法を用いて単離された細胞は生存可能であり、毒性研究、シグナル伝達経路の特性評価のための分子生化学的研究、フローサイトメトリーおよび遺伝子発現研究に使用することができる。この方法は、疾患を有する患者から細胞を単離するために、炎症性疾患のために、および直接研究のために癌などの他の疾患のためにも使用することができる。これらの疾患の例には、乾癬およびアトピー性皮膚炎が含まれる。
