がん細胞は、細胞外環境からATPなどの栄養素を内在化する著しい能力を有する。当社のプロトコルは、ATPの内部化を実証し、細胞内のATPローカリゼーションを可視化することを可能にします。マクロピノゾーム内の内部化ATPのこの高解像度イメージングは、特殊な局在化を理解し、内部化の量の分析を完了するのに理想的です。
このプロトコルは、ATP の内部化を検討するためのさまざまな実験アプリケーションについて説明します。この方法は、マクロピノサイトーシスおよびエキソソーム媒介性エンドサイトーシスを含む細胞内在化の異なるメカニズムを研究するために使用することができる。代謝性疾患の場合、非癌細胞におけるATP内在化は、このプロトコルで研究することができる。
まず、FBSと抗生物質を補ったDMEMを含む225平方センチメートルのフラスコに癌細胞を播種する。細胞培養インキュベーターで37°Cおよび5%の二酸化炭素で細胞が成長することを可能にする。80%合流が達成されたら、遠心分離によって細胞とペレットを取り外し細胞を取り外し、氷冷PBS中の細胞を再懸濁し、PBSの100マイクロリットル当たり6細胞に5倍の細胞密度を達成する。
細胞懸濁液を1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。75%エタノールで免疫不全マウスの側面の注射部位を洗浄し、繊細な作業ワイプで余分なエタノールを拭きます。27ゲージの精密滑空針を備えた1ミリリットルラテックスフリーシリンジに細胞を引き込みます。
皮下注射の場合は、針を皮膚に約10度の角度で保持し、ベベルを皮膚の下に向けて針先先を挿入し、針の針を皮膚の外に1〜2ミリメートルだけ保ちます。約10秒間、シリンジから細胞をゆっくりと分配します。全容を注入した後、針を3~5秒間所定の位置に持ち、針を引き出します。
注射部位に穏やかながらもしっかりとした圧力をかけ、注射した内容の漏れを防ぐために、指で3〜5秒間圧力をかけてください。腫瘍が200〜500立方ミリメートルの体積に達するまで、バーニエキャリパーを使用して腫瘍の成長を監視し、測定する。1ミリリットルの高分子量蛍光デキストランと無血清DMEMあたり16ミリグラムの300マイクロリットルを溶解し、水浴で30分間摂氏37度で焼戻し、次いで、デキストラン溶液を遠心分離し、上清を新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。
40マイクロリットルでは、1ミリモル非加水分解可能な蛍光ATPアナログストックを160マイクロリットルの無血清DMEMに、0.2ミリモル非無水分解蛍光ATP溶液にする。DMEMまたは8ミリグラム当たりミリグラム当たりの処理溶液を調製し、1ミリリットルの高分子量または低分子量蛍光デキストラン、DMEM中の100マイクロモル非無水分解蛍光ATPの有無にかかわらず、前に調製したストック溶液を混合して調製する。1ミリリットルのシリンジを使用して、1つの処理溶液の50マイクロリットルを収集します。
異種移植片腫瘍に直接溶液を注入し、各治療の4つの生物学的複製について繰り返す。マウスを安楽死させ、腫瘍組織を単離した後、穿穿なるスプーンを使用して切除された腫瘍組織をすくい上げ、すぐに組織を凍結媒体に入れ、組織を転がし、組織が培地の入浴、すべての組織表面に沈んだままであることを確認する。凍結培地を含む埋め込み型に組織を慎重に入れます。
対応するラベルタグを固定媒体または金型に垂直に配置し、書き込まれたラベルが媒体の外側に表示されるようにします。凍結媒体が白色に変わったら、組織ブロックをカビから取り出し、組織ブロックをドライアイスの上に置き、腫瘍部ごとに凍結を繰り返します。凍結切断手順の前に数ヶ月間マイナス80度で組織ブロックを保存します。
組織ブロックのスライドを作った後、95%エタノールの95%エタノールのスライドをマイナス18°Cで5分間固定します。固まった部分をPBSで5分間洗います。切片の大きさに応じて、DAPIを備えた水性取り付け媒体の10〜50マイクロリットルを組織セクションに加え、ガラスカバーを組織セクションの上に滑り込まします。
12〜24時間の装着後、固定腫瘍切片の対象領域を特定し、前述のように蛍光顕微鏡を用いて画像を取得する。ヒト腫瘍細胞固定の2~24時間後にDAPIで立ち、蛍光イメージングシステムとデータ取得ソフトウェアを用いて画像を撮影する。双眼鏡モードで直立性の上皮球顕微鏡のステージ上にスライドを置きます。
イメージングプログラムを開き、10倍の目的を選択し、フォーカスを定義するためにステージを調整します。左から右に蛇行してスライドをスキャンし、関心のある領域を識別します。40倍の目的を選択し、顕微鏡のトグルを使用して双眼鏡から画像キャプチャモードに切り替えます。
ライブ品質アイコンをクリックして画像を表示し、その後で取得します。取得ツールバーの OC パネルを使用して、各フィルターキューブまたは蛍光チャネルの露出パラメータを定義し、マルチチャネル取得ツールバーを使用して、定義された露出設定を持つ 3 つのチャンネル画像を取得します。あるいは、フィルタキューブ間での切り替え、露光時間の設定、各チャンネルの画像取得間のシャッターのクローズまたは開閉、個々のチャンネルで撮影した各画像のオーバーレイを行うことで、マルチチャンネル画像を手動で取得できます。
イメージを nd2 ファイルとして保存します。結合されたチャンネル画像や個々のチャンネル画像を含むTIFファイルを保存します。注釈および測定ツールバーのオブジェクトカウント機能を使用して、保存されたnd2画像ファイル上のNHF-ATP、TMR高分子量蛍光デキストランおよびTMR低分子量蛍光デキストラン陽性細胞の数をカウントし、分析プログラムを通じてスプレッドシートにデータをエクスポートします。
このプロトコルは、非加水分解性ATPの細胞内在化の空間的、時間的、定量的分析のために開発されました。非加水分解性蛍光ATPの細胞内内内イントラインタイゼーションは、インビトロ、エキズビボおよびインビボで高分子または低分子量蛍光デキストランを有する非加水分解蛍光ATPの共局在化によって実証された。腫瘍細胞が内在化ATPを保持することを確実にするために、全ての腫瘍内注射のための実験時間が限られた凍結埋め込み。
また、腫瘍全体の組織を画像化することによって腫瘍内変動を説明する。今後の反復では、E-ATPのインターナライズプロセスをリアルタイムで可視化し、マクロピノサイトティクスの動態と特定の組織における人身売買に関する情報を明らかにする可能性があります。
