このプロトコルは、光学的に気化したパーフルオロカーボンナノ液滴の簡単かつ迅速な合成を可能にし、これらの粒子の性能を高める方法を提供する。人物バージョンでは、超音波画像の位相を最初に操作するだけでコントラストを高めることができます。追加の機器を必要とせず、プログラム可能な超音波システムで実行できます。
まず、10ミリリットルの丸底フラスコをクロロホルムですすぎ、シリンジの全容量を繰り返し吸引して合計3回排出することにより、10マイクロリットルと1ミリリットルの気密ガラスシリンジをクロロホルムで洗い流します。シリンジを使用して、200マイクロリットルの25ミリグラム/ミリリットルDSPE-mPEG-2000、8マイクロリットルの10ミリグラム/ミリリットルのDSPC、および1ミリリットルあたり1ミリグラムのIR-1048を丸底フラスコに加えます。ストックの汚染を防ぐために、脂質または染料の間のシリンジをきれいにすることを忘れないでください。
ロータリーエバポレーターを利用して溶媒を除去します。バンピングを防ぐために、真空がゆっくりと332ミリバールに調整されていることを確認してください。5分後、圧力を42ミリバールに下げて、溶液に入った可能性のある水を取り除きます。
脂質ケーキを1ミリリットルのPBSに懸濁し、室温で5分間、またはすべての脂質ケーキが懸濁して溶液に溶解するまで超音波処理またはボルテックスする。溶液を7ミリリットルのガラスバイアルに移し、バイアルを氷で満たされたガラス皿に入れて、溶液を5分間冷却します。気密ガラスシリンジをペルフルオロヘキサンで洗い流します。
次に、シリンジを使用して50マイクロリットルのペルフルオロヘキサンをバイアルに加えます。プローブは、振幅を1に設定し、処理時間を20秒に設定し、パルスオンを1秒に設定し、パルスオフセットを5秒に設定して混合物を超音波処理します。次に、テキスト原稿に記載されているように設定を変更し、混合物をもう一度超音波処理します。
ナノ液滴溶液を1.5ミリリットルの遠沈管に移し、300gで3分間遠心分離して、1マイクロメートルを超える大きな液滴を小さな液滴から分離します。ペレットを廃棄し、上清を別の1.5ミリリットルの遠沈管に移します。3, 000gで5分間遠心分離して上清を洗浄し、溶液中のすべての液滴をペレット化します。
ペレットを上下にピペッティングして1ミリリットルのPBSにPFCnDを再懸濁し、バスソニケーターで1分間超音波処理します。PFCnDストックの10マイクロリットルを990マイクロリットルのPBSに追加し、サイズを測定する前にPFCnDを分散させるために超音波処理することにより、ストックPFCnDを100倍に希釈します。動的光散乱を使用して液滴のサイズを測定します。
500ミリリットルの真空フラスコに400ミリリットルの脱イオン水を満たして水を脱気し、ゴム栓で密封し、フラスコを真空ラインに接続します。真空ラインを開き、フラスコの底をバスソニケーターに沈めます。5分間、または気泡の形成が見られなくなるまで超音波処理します。
500ミリグラムを5ミリリットルの脱気水に溶解することにより、硫酸塩溶液あたり10%アンモニウムを調製します。過硫酸アンモニウムが完全に溶解しない場合は、溶液を静かに回転させます。攪拌プレート上に攪拌子が付いた400ミリリットルのビーカーに、150ミリリットルの脱気水と50ミリリットルの40アクリルアミドビスアクリルアミド溶液を加えて、200ミリリットルの10%アクリルアミドビスアクリルアミド溶液を形成します。
200 RPMで混合物を攪拌して、気泡を導入せずに適切に混合できるようにします。400ミリグラムのシリカを計量し、それを10%アクリルアミドビスアクリルアミド溶液に加えて、0.2%のシリカとアクリルアミド溶液を形成します。プラスチック製のトランスファーピペットからチップを切り取り、ラボテープで金型に支えて、円筒形の介在物を備えた正方形の型を準備します。
ビーカーに2ミリリットルの10%過硫酸アンモニウム溶液を加えて最終濃度を0.1%にし、250マイクロリットルのTEMEDをファントム溶液に加えます。溶液を1分未満攪拌します。溶液に気泡が入らないように注意しながら、溶液を金型にすばやく流し込みます。
溶液は10分以内に重合するはずです。ラボスパチュラの平らな端を金型の端に巻き付け、金型を反転させて、ファントムを取り外します。メーカーの指示に従って、パルスレーザーシステムの電源を入れ、約20分間ウォームアップします。
光ファイバーバンドルがレーザー出力に正しく接続され、2本の脚がファイバーバンドルホルダー内に正しく配置されていることを確認します。超音波イメージングシステムの電源を入れた後、アレイイメージングトランスデューサをシステムに接続し、トランスデューサをホルダー内に固定して、イメージング面をレーザー断面に合わせます。レーザーシステムのパルス繰り返し周波数を10ヘルツに設定し、ファイバーバンドルの端にパワーメーターを配置してエネルギーを測定します。
推定フルエンスが平方センチメートルあたり70ミリジュールになるまで、Qスイッチ遅延を調整します。1ミリリットルのプラスチックスリップチップシリンジを使用して、ポリアクリルアミドファントムのチャネルの1つを超音波ゲルとPFCnD混合物で埋め戻します。チャネルの上部を超音波ゲルで自由に覆い、1ミリリットルのプラスチックスリップチップシリンジで気泡を取り除きます。
最後に、ポリアクリルアミドファントムをトランスデューサーとファイバーバンドルの下に配置します。PFCnDの配合と遠心分離に成功すると、直径約200〜300ナノメートルの液滴が得られます。液滴のサイズは、オストワルド熟成として知られるプロセスでの合体と拡散により、時間とともに増加します。
エンドパルスの介在物とのコントラストは、Pパルスよりも約3.2倍、つまり220%改善されていることがわかりました。高エコー領域はフレームごとに計算され、最初のフレームの高エコー領域によって正規化され、指数関数的減衰モデルに適合されました。正規化された高エコー領域の特徴的な減衰時間は、Pパルスと比較してNパルスイメージングで最大3.5倍長かった。
Bモード微分画像フレームは、NパルスおよびPパルスイメージングごとに時間内に記録されました。最も重要なことの1つは、フラスコの底にある脂質を排出して、脂質ケーキに適切に取り込まれるようにすることです。
