Dieses Protokoll ermöglicht eine einfache und schnelle Synthese von optisch verdampften Perfluorcarbon-Nanotröpfchen und bietet eine Methode zur Verbesserung der Leistung dieser Partikel. Die Personenversion ermöglicht die Verbesserung des Kontrasts, indem zuerst die Phase der Ultraschallbildgebung manipuliert wird. Es erfordert keine zusätzliche Ausrüstung und kann auf jedem programmierbaren Ultraschallsystem durchgeführt werden.
Beginnen Sie mit dem Spülen eines 10-Milliliter-Rundkolbens mit Chloroform und waschen Sie eine 10 Mikroliter und einen Milliliter gasdichte Glasspritze mit Chloroform aus, indem Sie das gesamte Spritzenvolumen wiederholt absaugen und insgesamt dreimal ausstoßen. Mit den Spritzen werden 200 Mikroliter 25 Milligramm pro Milliliter DSPE-mPEG-2000, acht Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter DSPC und ein Milliliter ein Milligramm pro Milliliter IR-1048 in den runden Bodenkolben gegeben. Denken Sie daran, die Spritzen zwischen Lipiden oder Farbstoff zu reinigen, um eine Kontamination in der Brühe zu vermeiden.
Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer. Stellen Sie sicher, dass das Vakuum langsam auf 332 Millibar eingestellt wird, um Stöße zu vermeiden. Reduzieren Sie nach fünf Minuten den Druck auf 42 Millibar, um eventuell in die Lösung eingedrungenes Wasser zu entfernen.
Suspendieren Sie den Lipidkuchen in einem Milliliter PBS und beschallen oder wirbeln Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur oder bis der gesamte Lipidkuchen suspendiert und in der Lösung aufgelöst wurde. Die Lösung in eine Durchstechflasche aus Sieben-Milliliter-Glas geben und die Durchstechflasche in eine mit Eis gefüllte Glasschale geben, damit die Lösung fünf Minuten lang abkühlen kann. Spülen Sie eine gasdichte Glasspritze mit Perfluorhexan aus.
Dann geben Sie 50 Mikroliter Perfluorhexan mit der Spritze in die Durchstechflasche. Sonde beschallen Sie die Mischung mit der Amplitude auf eins, der Prozesszeit auf 20 Sekunden, dem Impuls auf eine Sekunde und dem Impuls auf fünf Sekunden. Ändern Sie dann die Einstellungen wie im Textmanuskript erwähnt und beschallen Sie die Mischung erneut.
Die Nano-Tröpfchenlösung wird in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und drei Minuten lang bei 300 g zentrifugiert, um die größeren Tröpfchen, die mehr als einen Mikrometer groß sind, von den kleineren Tröpfchen zu trennen. Das Pellet wird entsorgt und der Überstand in ein anderes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Waschen Sie den Überstand durch Zentrifugieren bei 3.000 g für fünf Minuten, um alle Tröpfchen in der Lösung zu pelletieren.
Suspendieren Sie die PFCnDs in einem Milliliter PBS, indem Sie das Pellet auf und ab pipettieren und dann eine Minute lang in einem Badesonikater beschallen. Verdünnen Sie die PFCnDs um das 100-fache, indem Sie 10 Mikroliter PFCnD-Material zu 990 Mikrolitern PBS und Badschall hinzufügen, um die PFCnDs zu dispergieren, bevor sie ihre Größe messen. Messen Sie die Größe der Tröpfchen mit dynamischer Lichtstreuung.
Entgasen Sie Wasser, indem Sie einen 500-Milliliter-Isolierkolben mit 400 Milliliter entionisiertem Wasser füllen, mit einem Gummikorken verschließen und den Kolben an die Vakuumleitung anschließen. Öffnen Sie die Vakuumleitung und tauchen Sie den Boden des Kolbens in den Badsonikater. Fünf Minuten lang nuktieren oder bis keine Gasblasenbildung mehr sichtbar ist.
Bereiten Sie 10% Ammonium pro Sulfatlösung vor, indem Sie 500 Milligramm in fünf Milliliter entgastem Wasser auflösen. Schwenken Sie die Lösung vorsichtig, wenn sich das Ammoniumpersulfat nicht vollständig auflöst. In einem 400-Milliliter-Becher mit einem Rührbalken auf einer Rührplatte werden 150 Milliliter entgastes Wasser und 50 Milliliter 40-Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung zu 200 Milliliter 10%iger Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung hinzugefügt.
Rühren Sie die Mischung bei 200 U/min, um eine ordnungsgemäße Mischung ohne Blasen zu ermöglichen. Wiegen Sie 400 Milligramm Kieselsäure aus und fügen Sie es der 10% igen Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung hinzu, um eine 0,2% ige Siliciumdioxid- und Acrylamidlösung zu bilden. Bereiten Sie eine quadratische Form mit zylindrischem Einschluss vor, indem Sie die Spitzen von einer Kunststofftransferpipette abschneiden und mit Laborband in der Form abstützen.
Zwei Milliliter 10%ige Ammoniumpersulfatlösung in das Becherglas geben, um eine Endkonzentration von 0,1% zu erhalten, und 250 Mikroliter TEMED in die Phantomlösung geben. Lassen Sie die Lösung weniger als eine Minute rühren. Gießen Sie die Lösung schnell in die Form und achten Sie darauf, keine Luftblasen in die Lösung einzuführen.
Die Lösung sollte innerhalb von 10 Minuten polymerisieren. Entfernen Sie das Phantom, indem Sie das flache Ende eines Laborspatels um den Rand der Form laufen lassen und die Form umkehren. Schalten Sie das gepulste Lasersystem ein und erwärmen Sie es ca. 20 Minuten lang gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Stellen Sie sicher, dass das faseroptische Bündel ordnungsgemäß mit dem Laserausgang verbunden ist und die beiden Beine ordnungsgemäß im Faserbündelhalter platziert sind. Schließen Sie nach dem Einschalten des Ultraschallbildgebungssystems den Array-Bildwandler an das System an und befestigen Sie den Schallkopf im Halter, um seine Bildebene mit dem Laserquerschnitt auszurichten. Stellen Sie die Pulswiederholfrequenz des Lasersystems auf 10 Hertz ein und platzieren Sie einen Leistungsmesser am Ende des Faserbündels, um die Energie zu messen.
Stellen Sie die Q-Schaltverzögerung ein, bis die geschätzte Fluenz 70 Milijoule pro Quadratzentimeter beträgt. Verfüllung eines der Kanäle im Polyacrylamidphantom mit dem Ultraschallgel und der PFCnD-Mischung mit einer Ein-Milliliter-Kunststoff-Slip-Tip-Spritze. Decken Sie die Oberseite des Kanals großzügig mit Ultraschallgel ab und entfernen Sie alle Blasen mit einer Ein-Milliliter-Kunststoff-Slip-Tip-Spritze.
Platzieren Sie schließlich das Polyacrylamidphantom unter dem Schallkopf und dem Faserbündel. Die erfolgreiche Formulierung und zentrifugale Trennung der PFCnDs liefert Tröpfchen mit einem Durchmesser von etwa 200 bis 300 Nanometern. Die Größe der Tröpfchen nimmt im Laufe der Zeit aufgrund von Koaleszenzierung und Diffusion in einem Prozess zu, der als Ostwaldreifung bekannt ist.
Der Kontrast zum Einschluss für den Endpuls war etwa 3,2-mal größer, das ist eine Verbesserung von 220% als der P-Puls. Die reflexionsarme Fläche wurde für jedes Bild berechnet und um die reflexionsarme Fläche des ersten Frames normalisiert und dann an ein exponentielles Zerfallsmodell angepasst. Die charakteristische Abklingzeit des normalisierten hyperechoarmen Bereichs war in der N-Puls-Bildgebung bis zu 3,5-mal länger als im P-Puls.
Die differentiellen B-Mode-Bildrahmen wurden rechtzeitig für jede N-Puls- und P-Puls-Bildgebung aufgezeichnet. Eines der wichtigsten Dinge ist, die Lipide am Boden des Kolbens auszustoßen, um sicherzustellen, dass sie richtig in den Lipidkuchen eingearbeitet werden.
