Este protocolo permite uma síntese simples e rápida de nanogotículas de perfluorocarbono opticamente vaporizadas e fornece um método para melhorar o desempenho dessas partículas. A versão Person permite o aprimoramento do contraste apenas manipulando a fase da imagem de ultrassom primeiro. Não requer equipamento adicional e pode ser realizado em qualquer sistema de ultrassom programável.
Comece por enxaguar um balão de fundo redondo de 10 mililitros com clorofórmio e lave uma seringa de vidro apertada a gás de 10 microlitros e um mililitro com clorofórmio, aspirando repetidamente o volume total da seringa e expelindo-o um total de três vezes. Usando as seringas, adicione 200 microlitros de 25 miligramas por mililitro DSPE-mPEG-2000, oito microlitros de 10 miligramas por mililitro DSPC e um mililitro de um miligrama por mililitro IR-1048 no frasco de fundo redondo. Lembre-se de limpar as seringas entre lipídios ou corante para evitar a contaminação no estoque.
Remova o solvente utilizando um evaporador rotativo. Certifique-se de que o vácuo seja ajustado lentamente para 332 milibares para evitar colisões. Após cinco minutos, reduza a pressão para 42 milibares para remover qualquer água que possa ter entrado na solução.
Suspenda o bolo lipídico em um mililitro de PBS e sonicate ou vórtice à temperatura ambiente por cinco minutos ou até que todo o bolo lipídico tenha sido suspenso e dissolvido na solução. Transfira a solução para um frasco para injetáveis de vidro de sete mililitros e coloque o frasco para injetáveis num prato de vidro cheio de gelo para permitir que a solução arrefeça durante cinco minutos. Enxaguar uma seringa de vidro à prova de gás com perfluorohexano.
Em seguida, adicione 50 microlitros de perfluorohexano ao frasco para injetáveis utilizando a seringa. Sonda sonicate a mistura com a amplitude definida para um, o tempo de processo definido para 20 segundos, pulso em set para um segundo, e pulso off definido para cinco segundos. Em seguida, altere as configurações mencionadas no manuscrito do texto e sonicate a mistura mais uma vez.
Transfira a solução de nano gotículas para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e centrífuga a 300g por três minutos para separar as gotículas maiores, que são mais de um micrômetro das gotículas menores. Descarte o pellet e transfira o sobrenadante para outro tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Lave o sobrenadante centrifugando a 3.000g por cinco minutos para colocar todas as gotículas na solução.
Ressuspeite os PFCnDs em um mililitro de PBS pipetando a pelota para cima e para baixo e, em seguida, sonice em um sonicater de banho por um minuto. Diluir o estoque de PFCnDs 100 vezes adicionando 10 microlitros de estoque de PFCnD a 990 microlitros de PBS e banho sonicate para dispersar os PFCnDs antes de medir seu tamanho. Meça o tamanho das gotículas usando o espalhamento dinâmico de luz.
Desgaseifique a água enchendo um balão de vácuo de 500 mililitros com 400 mililitros de água deionizada, sele com uma cortiça de borracha e ligue o balão à linha de vácuo. Abra a linha de vácuo e submerja o fundo do balão no sonicater de banho. Sonicate por cinco minutos ou até que nenhuma formação de bolhas de gás seja visível.
Prepare 10% de amônio por solução de sulfato dissolvendo 500 miligramas em cinco mililitros de água desgaseificada. Agite suavemente a solução se o persulfato de amónio não se dissolver totalmente. Em um copo de 400 mililitros com uma barra de agitação em uma placa de agitação, adicione 150 mililitros de água desgaseificada e 50 mililitros de solução de 40 acrilamida bisacrilamida para formar 200 mililitros de solução de bisacrilamida a 10%.
Mexa a mistura a 200 RPM para permitir uma mistura adequada sem introduzir bolhas. Pesar 400 miligramas de sílica e adicioná-lo à solução de bisacrilamida a 10% de acrilamida para formar uma solução de 0,2% de sílica e acrilamida. Prepare um molde quadrado com uma inclusão cilíndrica, cortando as pontas de uma pipeta de transferência de plástico e apoiando-a no molde com fita adesiva de laboratório.
Adicionar dois mililitros de solução de persulfato de amónio a 10% ao copo para obter uma concentração final de 0,1% e adicionar 250 microlitros de TEMED à solução fantasma. Deixe a solução mexer por menos de um minuto. Despeje rapidamente a solução no molde, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução.
A solução deve polimerizar dentro de 10 minutos. Remova o fantasma passando a extremidade plana de uma espátula de laboratório ao redor da borda do molde e invertendo o molde. Ligue e aqueça o sistema de laser pulsado por aproximadamente 20 minutos seguindo as instruções do fabricante.
Certifique-se de que o feixe de fibra óptica esteja conectado corretamente à saída do laser e que as duas pernas estejam adequadamente colocadas dentro do suporte do feixe de fibra. Depois de ligar o sistema de imagem de ultrassom, conecte o transdutor de imagem de matriz ao sistema e fixe o transdutor dentro do suporte para alinhar seu plano de imagem com a seção transversal a laser. Defina a frequência de repetição de pulso do sistema a laser para 10 hertz e coloque um medidor de energia no final do feixe de fibras para medir a energia.
Ajuste o atraso do interruptor Q até que a fluência estimada seja de 70 milijoule por centímetro quadrado. Encha um dos canais no simulador de poliacrilamida com o gel de ultrassom e a mistura de PFCnD usando uma seringa de ponta deslizante de plástico de um mililitro. Cubra liberalmente a parte superior do canal com gel de ultrassom e remova todas as bolhas com uma seringa de ponta deslizante de plástico de um mililitro.
Finalmente, coloque o fantasma de poliacrilamida sob o transdutor e o feixe de fibras. A formulação bem-sucedida e a separação centrífuga dos PFCnDs produzem gotículas com cerca de 200 a 300 nanômetros de diâmetro. O tamanho das gotículas aumenta ao longo do tempo devido à coalescência e difusão em um processo conhecido como amadurecimento de Ostwald.
O contraste da inclusão para o pulso final foi aproximadamente 3,2 vezes maior, ou seja, uma melhora de 220% em relação ao pulso P. A área hiperecoica foi calculada para cada quadro e normalizada pela área hiperecoica do primeiro quadro e, em seguida, ajustada a um modelo de decaimento exponencial. O tempo de decaimento característico da área hiperecoica normalizada foi até 3,5 vezes maior na imagem de pulso N em comparação com o pulso P.
Os quadros diferenciais de imagem do modo B foram registrados no tempo para cada imagem de pulso N e pulso P. Uma das coisas mais importantes é expelir os lipídios no fundo do frasco para garantir que eles sejam devidamente incorporados ao bolo lipídico.
