このプロトコールは、酸化還元機構との干渉を避けるために、低レベルのBH4および硝酸塩を含む慎重に定義された培地および血清を使用して、iNOSまたはBH4欠損マウスからの骨髄由来マクロファージを培養するのに役立ちます。培養プロセスにおける潜在的な汚染物質のレベルを慎重に制御することにより、一酸化窒素干渉を制限し、モデルシステムの精度と再現性を確保することができます。この方法は、ビオプテリン、一酸化窒素、およびこれらの必須化合物に関連する下流因子の正確な測定を可能にする。
この手順を実演するのは、私たちの研究室のポスドク研究員であるThomas Nichol博士です。まず、脚を70%エタノールに2分間入れて、毛皮や残留物を洗い流します。次に、脚を清潔で無菌の細菌学的ペトリ皿に移します。
刃で骨の長さに沿って慎重にこすり、腱を切り裂き、骨から筋肉を取り除きます。骨から筋肉が取り除かれたら、膝のすぐ下の脛骨の上部にある骨端を切り取ります。脛骨は、腓骨との交差点のすぐ上の下端で切断することができる。
最後に、膝関節と股関節のすぐ手前にある大腿骨の両端の骨端を切り取ります。骨髄を洗い流すには、10ミリリットルのシリンジに10ミリリットルのPBSを入れ、針に取り付けます。次に、針を骨の髄腔に挿入する。
1〜2ミリリットルのPBSで静かに洗い流し、針を上下に動かします。次いで、懸濁液を1ミリリットルのシリンジに5〜10回出し入れして解凝集させる。懸濁液を1ミリリットルのシリンジに集め、70マイクロメートルのセルストレーナーに通して清潔な50ミリリットルの遠沈管に入れます。
最後に、サンプルを氷の上に置きます。後で使用するために骨髄を凍結するには、細胞を1000Gで室温で5分間遠心分離する。上清を捨て、赤色ペレットを2ミリリットルの不凍液に再懸濁する。
その後、摂氏80度で一晩インキュベートします。凍結した場合は、サスペンションを摂氏 37 度で急速に解凍します。細胞懸濁液を、3ミリリットルのDMEM/F-12培地を含む清浄な滅菌チューブに移す。
次に、遠心分離により細胞をペレット化する。上清を捨て、ペレットを調製したDMEM/F-12培地3ミリリットルに再懸濁する。細胞をカウントし、調製したDMEM/F-12培地中の非TCコーティングされたプラスチック製品にプレートします。
次に、細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素でインキュベートする。5日目に、DMEM/F-12培地の元の容量の50%を加えて細胞に供給します。6日目に、調製したGM-CSFを終濃度50ナノグラム/マイクロリットルに細胞培養培地に直接添加して細胞を刺激する。
7日目に、細胞からすべての培地を除去します。次いで、予め加温したPBSで細胞を短時間洗浄し、2%低エンドトキシンFBS、1Xペニシリンまたはストレプトマイシン、L-グルタミン、M-CSFあたり25ナノグラム、およびGM-CSFマイクロリットルあたり50ナノグラムを含むDMEM/F-12培地を加える。最後に、細胞を培地中で一晩インキュベートし、マクロファージをM0表現型に活性化する。
M1表現型の場合、LPSあたり100ナノグラム、およびマイクロリットルあたり10ナノグラムのIFN-γで細胞を刺激する。M2表現型の場合、1マイクロリットルあたり100ナノグラムのIL-4で細胞を刺激する。細胞を一晩インキュベートする。
8日目に、細胞は研究者のニーズに応じて収穫または下流処理の準備が整います。10%FBSを補充した培地は、M-CSFおよびGM-CSF、またはLCMにかかわらず、類似の亜硝酸塩およびテトラヒドロビオプテリンを有していた。しかし、総ビオプテリンレベルはLCM補充培地で高かった。
しかしながら、異なるLCMバッチ間でより多くの変動性は観察されなかった。PCRは野生型マウスで1030塩基対産物を示し、一方GCHノックアウトマウスは1392塩基対産物を産生し、臨界エクソンの切除を確認した。タモキシフェン処理はノックアウト細胞中のGCHタンパク質を消失させた。
ノックアウトおよびコントロール細胞は、LPSおよびIFN刺激後も依然としてiNOSを産生した。条件付きGCHノックアウトマウスから培養したBMDMは、テトラヒドロビオプテリンの有意な減少および亜硝酸塩の減少を示した。LCM培地で培養した同じ細胞はGCH1発現を有さなかった。
しかし、細胞はノックアウト後にかなりの量のテトラヒドロビオプテリンおよび亜硝酸塩を産生する。8日目に、異なる濃度のタモキシフェンにおける非活性化対照とGCHノックアウトBMDMとの間に形態に有意差はなかった。BMDMは、丸い付着細胞と細長い四肢を有する非刺激マクロファージに期待される特徴を示す。
このような一次細胞を扱う場合、すべての組織と機器を徹底的に滅菌することが不可欠です。さらに、適切な培地およびサプリメントを選択することは、低一酸化窒素およびBH4環境を維持するために重要である。細胞ペレットおよび培地は、一酸化窒素、ビオプテリン、または細胞酸化還元状態の役割に焦点を当てて、様々な下流用途に使用することができる。
それは、とりわけHPLC、qPCR、およびウェスタンブロットを含み得る。
