Este protocolo ajuda a criar macrófagos derivados da medula óssea de camundongos deficientes iNOS ou BH4 usando mídia e soro cuidadosamente definidos com baixos níveis de BH4 e nitrato para evitar interferências com mecanismos de redox. Controlando cuidadosamente os níveis de potenciais contaminantes no processo de cultura, podemos limitar a interferência de óxido nítrico, garantindo precisão e reprodutibilidade do sistema modelo. Este método permite medições precisas de biopterinas, óxido nítrico e quaisquer fatores a jusante relacionados a esses compostos essenciais.
Demonstrando o procedimento estará o Dr. Thomas Nichol, um pesquisador de pós-doutorado do nosso laboratório. Para começar, coloque as pernas em 70% de etanol por dois minutos para lavar qualquer pele ou resíduo. Em seguida, transfira as pernas para uma placa de Petri bacteriológica limpa e estéril.
Raspe cuidadosamente ao longo do comprimento dos ossos com a lâmina, cortando os tendões e removendo o músculo do osso. Uma vez que os ossos tenham sido limpos de músculo, corte a epífise no topo da tíbia, logo abaixo do joelho. A tíbia pode ser cortada na extremidade inferior, logo acima do cruzamento com a fíbula.
Finalmente, corte a epífise em cada extremidade do fêmur, logo após as articulações do joelho e quadril. Para lavar a medula óssea, encha uma seringa de 10 mililitros com 10 mililitros de PBS e anexe-a a uma agulha. Em seguida, insira a agulha na cavidade medular do osso.
Levemente alinhado com um a dois mililitros de PBS, executando a agulha para cima e para baixo. Em seguida, desenhe a suspensão cinco a dez vezes dentro e fora de uma seringa mililitro para desagregar. Colete a suspensão em uma seringa de um mililitro e passe-a através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo de centrífuga de 50 mililitros limpo.
Finalmente, coloque as amostras no gelo. Para congelar a medula óssea para uso posterior, centrifugar as células a 1000 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota vermelha em dois mililitros de anticongelante.
Em seguida, incubar-lo a 80 graus Celsius durante a noite. Se congelado, descongele a suspensão rapidamente a 37 graus Celsius. Transfira a suspensão da célula para um tubo limpo estéril contendo três mililitros de mídia DMEM/F-12.
Em seguida, pelota as células por centrifugação. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em três mililitros da mídia DMEM/F-12 preparada. Conte as células e as emplaque em plástico revestido não TC na mídia DMEM/F-12 preparada.
Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No quinto dia, alimente as células adicionando 50% do volume original de mídia DMEM/F-12. No sexto dia, estimule as células adicionando GM-CSF preparado a uma concentração final de 50 nanogramas por microliter diretamente à mídia de cultura celular.
No sétimo dia, remova toda a mídia das células. Em seguida, lave as células brevemente com PBS pré-aquecido e adicione mídia DMEM/F-12 contendo 2% de baixa endotoxina FBS, penicilina 1X ou estreptomicina, L-glutamina, 25 nanogramas por microliter M-CSF, e 50 nanogramas por microliter GM-CSF. Finalmente, incubar as células durante a noite na mídia para ativar os macrófagos ao fenótipo M0.
Para o fenótipo M1, estimule as células com 100 nanogramas por LPS microliter, e 10 nanogramas por microliter IFN-gama. Para o fenótipo M2, estimule as células com 100 nanogramas por microliter IL-4. Incubar as células durante a noite.
No oitavo dia, as células estão prontas para colheita ou processamento a jusante de acordo com as necessidades do pesquisador. A mídia suplementada com 10% de FBS tinha nitrito e tetrahidrobiopterina semelhantes, independentemente de M-CSF e GM-CSF, ou LCM. Mas os níveis totais de biopterina foram mais elevados na mídia suplementada de LCM.
No entanto, observou-se maior variabilidade entre diferentes lotes de LCM. PcR mostrou um produto de par de base 1030 em ratos do tipo selvagem, enquanto os ratos de nocaute GCH produziram um produto de par base 1392, confirmando a excisão dos exons críticos. O tratamento de tamoxifen aboliu a proteína GCH nas células eliminatórias.
As células de nocaute e controle ainda produziam iNOS, seguindo lps e estimulação IFN. BMDMs cultivados a partir de camundongos eliminatórios GCH condicional apresentaram tetrahidrobiopterina significativamente diminuída e diminuição do nitrito. As mesmas células cultivadas nos meios de LCM não tinham expressão GCH1.
No entanto, as células produzem quantidades significativas de tetrahidrobiopterina e nitrito após nocaute. No oitavo dia, não houve diferenças significativas na morfologia entre o controle não ativado e os BMDMs de nocaute de GCH em diferentes concentrações de Tamoxifen. Os BMDMs exibem as características esperadas de macrófagos não estimulados, com células aderentes redondas e extremidades alongadas.
Ao trabalhar com células primárias como esta, é imperativo esterilizar todos os tecidos e equipamentos completamente. Além disso, escolher a mídia e o suplemento certos é importante para manter um baixo óxido nítrico e ambiente BH4. Pelotas celulares e mídia podem ser usadas para várias aplicações a jusante, com foco no papel de óxido nítrico, biopterina ou estado de redox celular.
Pode incluir HPLC, qPCR e mancha ocidental, entre outros.
