该方案有助于使用精心定义的培养基和血清培养来自iNOS或BH4缺陷小鼠的骨髓来源的巨噬细胞，这些培养基和血清具有低水平的BH4和硝酸盐，以避免干扰氧化还原机制。通过仔细控制培养过程中潜在污染物的水平，我们可以限制一氧化氮干扰，确保模型系统的准确性和可重复性。这种方法可以精确测量生物蝶呤，一氧化氮以及与这些必需化合物相关的任何下游因素。
演示该程序的将是来自我们实验室的博士后研究员Thomas Nichol博士。首先，将腿放在70%乙醇中两分钟，以洗掉任何毛皮或残留物。然后，将腿部转移到干净，无菌的细菌培养皿中。
用刀片小心地沿着骨骼的长度刮擦，切开肌腱并从骨骼上取下肌肉。一旦骨头被清除了肌肉，切开胫骨顶部，膝盖正下方的骨骺。胫骨可以在底端切开，就在与腓骨相交处的正上方。
最后，切开股骨两端的骨骺，刚好靠近膝关节和髋关节。要冲洗骨髓，用10毫升PBS填充10毫升注射器并将其连接到针头上。然后将针头插入骨的髓质腔中。
用一到两毫升PBS轻轻冲洗，上下运行针头。然后，将悬浮液吸入和拔出一毫升注射器五到十次以分解。将悬浮液收集在一毫升注射器中，并通过70微米细胞过滤器进入干净的50毫升离心管。
最后，将样品放在冰上。为了冷冻骨髓供以后使用，在室温下以1000G离心细胞五分钟。弃去上清液并将红色沉淀重悬于两毫升防冻液中。
然后，将其在80摄氏度下孵育过夜。如果冷冻，请在37摄氏度下快速解冻悬浮液。将细胞悬浮液转移到含有三毫升DMEM / F-12培养基的干净无菌管中。
接下来，通过离心沉淀细胞。弃去上清液并将沉淀重悬于三毫升制备的DMEM / F-12培养基中。计数细胞并将其置入制备的DMEM / F-12培养基中的非TC涂层塑料器皿中。
接下来，将细胞在37摄氏度下与5%二氧化碳一起孵育。在第五天，通过添加50%原始体积的DMEM / F-12培养基来喂养细胞。在第六天，通过将制备的GM-CSF以每微升50纳克的最终浓度直接添加到细胞培养基中来刺激细胞。
在第七天，从细胞中取出所有培养基。然后，用预热的PBS短暂洗涤细胞，并加入含有2%低内毒素FBS，1X青霉素或链霉素，L-谷氨酰胺，每微升M-CSF25纳克和每微升GM-CSF50纳克的DMEM / F-12培养基。最后，将细胞在培养基中孵育过夜，以激活巨噬细胞至M0表型。
对于M1表型，用每微升LPS100纳克和每微升IFN-γ10纳克刺激细胞。对于M2表型，用每微升IL-4100纳克刺激细胞。将细胞孵育过夜。
在第八天，细胞根据研究人员的需求准备好收获或下游处理。补充10%FBS的培养基具有相似的亚硝酸盐和四氢生物蝶呤，无论M-CSF和GM-CSF或LCM如何。但在LCM补充培养基中，总生物蝶呤水平较高。
然而，观察到不同LCM批次之间的变异性更大。PCR在野生型小鼠中显示出1030个碱基对产物，而GCH敲除小鼠产生了1392个碱基对产物，证实了关键外显子的切除。他莫昔芬治疗消除了敲除细胞中的GCH蛋白。
在LPS和IFN刺激之后，敲除和控制细胞仍然产生iNOS。从条件GCH敲除小鼠培养的BMDM表现出显着减少的四氢生物蝶呤和减少的亚硝酸盐。在LCM培养基中培养的相同细胞没有GCH1表达。
然而，细胞在敲除后产生大量的四氢生物蝶呤和亚硝酸盐。第8天，不同浓度他莫昔芬下，非激活对照组和GCH敲除BMDM在形态上无显著差异。BMDM显示了未受刺激的巨噬细胞所期望的特征，具有圆形贴壁细胞和细长的四肢。
在处理这样的原代细胞时，必须彻底消毒所有组织和设备。此外，选择合适的培养基和补充剂对于保持低一氧化氮和BH4环境非常重要。细胞沉淀和培养基可用于各种下游应用，重点是一氧化氮，生物蝶呤或细胞氧化还原状态的作用。
它可能包括HPLC，qPCR和蛋白质印迹等。
