Dieses Protokoll hilft bei der Kultivierung von aus dem Knochenmark abgeleiteten Makrophagen von iNOS- oder BH4-defizienten Mäusen unter Verwendung sorgfältig definierter Medien und Serum mit niedrigen BH4- und Nitratspiegeln, um Interferenzen mit Redoxmechanismen zu vermeiden. Durch die sorgfältige Kontrolle der Konzentrationen potenzieller Verunreinigungen im Kulturprozess können wir Stickoxidinterferenzen begrenzen und so die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Modellsystems sicherstellen. Diese Methode ermöglicht genaue Messungen von Biopterinen, Stickstoffmonoxid und allen nachgelagerten Faktoren, die mit diesen essentiellen Verbindungen zusammenhängen.
Das Verfahren wird Dr. Thomas Nichol, ein Postdoktorand aus unserem Labor, demonstrieren. Um zu beginnen, legen Sie die Beine in 70% Ethanol für zwei Minuten, um Fell oder Rückstände abzuwaschen. Dann die Beine in eine saubere, sterile bakteriologische Petrischale geben.
Kratzen Sie vorsichtig entlang der Länge der Knochen mit der Klinge, schneiden Sie die Sehnen durch und entfernen Sie den Muskel aus dem Knochen. Sobald die Knochen von Muskeln befreit sind, schneiden Sie durch die Epiphyse an der Oberseite der Tibia, direkt unter dem Knie. Die Tibia kann am unteren Ende, direkt über dem Schnittpunkt mit der Wadenbein, durchtrennt werden.
Schneiden Sie schließlich die Epiphyse an beiden Enden des Femurs durch, kurz vor den Knie- und Hüftgelenken. Um das Knochenmark zu spülen, füllen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit 10 Millilitern PBS und befestigen Sie sie an einer Nadel. Führen Sie dann die Nadel in die Markhöhle des Knochens ein.
Spülen Sie vorsichtig mit ein bis zwei Millilitern PBS und führen Sie die Nadel auf und ab. Ziehen Sie dann die Aufhängung fünf- bis zehnmal in und aus einer Ein-Milliliter-Spritze, um sie zu disaggregieren. Sammeln Sie die Suspension in einer Ein-Milliliter-Spritze und führen Sie sie durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein sauberes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Zum Schluss legen Sie die Proben auf Eis. Um das Knochenmark für den späteren Gebrauch einzufrieren, zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das rote Pellet in zwei Millilitern Frostschutzmittel.
Dann über Nacht bei 80 Grad Celsius inkubieren. Wenn gefroren, tauen Sie die Suspension bei 37 Grad Celsius schnell auf. Überführen Sie die Zellsuspension in ein sauberes steriles Röhrchen, das drei Milliliter DMEM/F-12-Medien enthält.
Als nächstes pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in drei Millilitern des vorbereiteten DMEM/F-12-Mediums. Zählen Sie die Zellen und beschichten Sie sie mit nicht TC-beschichtetem Kunststoff in den vorbereiteten DMEM/F-12-Medien.
Als nächstes inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Füttern Sie die Zellen am fünften Tag, indem Sie 50% des ursprünglichen Volumens der DMEM/F-12-Medien hinzufügen. Stimulieren Sie am sechsten Tag die Zellen, indem Sie vorbereitetes GM-CSF zu einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Mikroliter direkt in die Zellkulturmedien geben.
Entfernen Sie am siebten Tag alle Medien aus den Zellen. Dann waschen Sie die Zellen kurz mit vorgewärmtem PBS und fügen Sie DMEM / F-12-Medien hinzu, die 2% niedriges Endotoxin-FBS, 1X Penicillin oder Streptomycin, L-Glutamin, 25 Nanogramm pro Mikroliter M-CSF und 50 Nanogramm pro Mikroliter GM-CSF enthalten. Schließlich inkubieren Sie die Zellen über Nacht in Medien, um die Makrophagen zum M0-Phänotyp zu aktivieren.
Für den M1-Phänotyp stimulieren Sie die Zellen mit 100 Nanogramm pro Mikroliter LPS und 10 Nanogramm pro Mikroliter IFN-gamma. Für den M2-Phänotyp stimulieren Sie die Zellen mit 100 Nanogramm pro Mikroliter IL-4. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.
Am achten Tag sind die Zellen bereit für die Ernte oder die nachgelagerte Verarbeitung, je nach den Bedürfnissen des Forschers. Medien, die mit 10% FBS ergänzt wurden, hatten ähnliche Nitrit und Tetrahydrobiopterin, unabhängig von M-CSF und GM-CSF oder LCM. Aber die Gesamtbiopterinspiegel waren in LCM-ergänzten Medien höher.
Es wurde jedoch eine größere Variabilität zwischen verschiedenen LCM-Chargen beobachtet. Die PCR zeigte ein 1030-Basenpaar-Produkt in Wildtyp-Mäusen, während GCH-Knockout-Mäuse ein 1392-Basenpaar-Produkt produzierten, das die Exzision der kritischen Exons bestätigte. Die Behandlung mit Tamoxifen schaffte das GCH-Protein in den Knockout-Zellen ab.
Knockout- und Kontrollzellen produzierten nach LPS- und IFN-Stimulation immer noch iNOS. BMDMs, die von bedingten GCH-Knockout-Mäusen kultiviert wurden, zeigten signifikant vermindertes Tetrahydrobiopterin und vermindertes Nitrit. Die gleichen Zellen, die in LCM-Medien kultiviert wurden, hatten keine GCH1-Expression.
Die Zellen produzieren jedoch nach dem Knockout erhebliche Mengen an Tetrahydrobiopterin und Nitrit. Am achten Tag gab es keine signifikanten Unterschiede in der Morphologie zwischen nicht aktivierten Kontroll- und GCH-Knockout-BMDMs bei unterschiedlichen Tamoxifen-Konzentrationen. Die BMDMs zeigen die Merkmale, die von unstimulierten Makrophagen erwartet werden, mit runden adhärenten Zellen und länglichen Extremitäten.
Wenn Sie mit einer solchen Primärzelle arbeiten, ist es unerlässlich, das gesamte Gewebe und die Ausrüstung gründlich zu sterilisieren. Darüber hinaus ist die Wahl der richtigen Medien und Nahrungsergänzungsmittel wichtig, um eine Umgebung mit niedrigem Stickoxid- und BH4-Gehalt aufrechtzuerhalten. Zellpellets und -medien können für verschiedene nachgelagerte Anwendungen verwendet werden, wobei der Schwerpunkt auf der Rolle von Stickstoffmonoxid, Biopterin oder zellulärem Redoxzustand liegt.
Es kann unter anderem HPLC, qPCR und Western Blot umfassen.
