Ce protocole aide à cultiver des macrophages dérivés de la moelle osseuse à partir de souris déficientes en iNOS ou bh4 en utilisant des milieux et un sérum soigneusement définis avec de faibles niveaux de BH4 et de nitrate pour éviter toute interférence avec les mécanismes redox. En contrôlant soigneusement les niveaux de contaminants potentiels dans le processus de culture, nous pouvons limiter les interférences de l’oxyde nitrique, assurant ainsi la précision et la reproductibilité du système modèle. Cette méthode permet des mesures précises des bioptérines, de l’oxyde nitrique et de tout facteur en aval lié à ces composés essentiels.
Le Dr Thomas Nichol, chercheur postdoctoral de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, placez les jambes dans de l’éthanol à 70% pendant deux minutes pour laver toute fourrure ou résidu. Ensuite, transférez les jambes dans une boîte de Petri bactériologique propre et stérile.
Grattez soigneusement le long des os avec la lame, coupez à travers les tendons et retirez le muscle de l’os. Une fois que les os ont été débarrassés du muscle, coupez à travers l’épiphyse au sommet du tibia, juste en dessous du genou. Le tibia peut être coupé à l’extrémité inférieure, juste au-dessus de l’intersection avec le péroné.
Enfin, coupez à travers l’épiphyse à chaque extrémité du fémur, juste à côté des articulations du genou et de la hanche. Pour rincer la moelle osseuse, remplissez une seringue de 10 millilitres avec 10 millilitres de PBS et fixez-la à une aiguille. Insérez ensuite l’aiguille dans la cavité médullaire de l’os.
Rincez doucement avec un à deux millilitres de PBS, en faisant passer l’aiguille de haut en bas. Ensuite, tirez la suspension cinq à dix fois dans et hors d’une seringue d’un millilitre pour la désagréger. Recueillir la suspension dans une seringue d’un millilitre et la faire passer à travers une passoire à cellules de 70 micromètres dans un tube de centrifugeuse propre de 50 millilitres.
Enfin, placez les échantillons sur de la glace. Pour congeler la moelle osseuse pour une utilisation ultérieure, centrifuger les cellules à 1000 G pendant cinq minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille rouge dans deux millilitres d’antigel.
Ensuite, incubez-le à 80 degrés Celsius pendant la nuit. En cas de congélation, décongeler rapidement la suspension à 37 degrés Celsius. Transférer la suspension cellulaire dans un tube stérile propre contenant trois millilitres de milieu DMEM/F-12.
Ensuite, abattez les cellules par centrifugation. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans trois millilitres du milieu DMEM/F-12 préparé. Comptez les cellules et plaquez-les dans des articles en plastique non revêtus de TC dans le milieu DMEM/F-12 préparé.
Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le cinquième jour, nourrissez les cellules en ajoutant 50% du volume d’origine de milieuX DMEM/F-12. Le sixième jour, stimulez les cellules en ajoutant du GM-CSF préparé à une concentration finale de 50 nanogrammes par microlitre directement dans le milieu de culture cellulaire.
Le septième jour, retirez tous les médias des cellules. Ensuite, lavez brièvement les cellules avec du PBS préchauffé et ajoutez un milieu DMEM / F-12 contenant 2% de FBS à faible teneur en endotoxine, 1X pénicilline ou streptomycine, L-glutamine, 25 nanogrammes par microlitre M-CSF et 50 nanogrammes par microlitre GM-CSF. Enfin, incuber les cellules pendant la nuit dans un milieu pour activer les macrophages au phénotype M0.
Pour le phénotype M1, stimuler les cellules avec 100 nanogrammes par microlitre LPS, et 10 nanogrammes par microlitre IFN-gamma. Pour le phénotype M2, stimuler les cellules avec 100 nanogrammes par microlitre IL-4. Incuber les cellules pendant la nuit.
Au huitième jour, les cellules sont prêtes pour la récolte ou le traitement en aval selon les besoins du chercheur. Les milieux complétés par 10% FBS contenaient des nitrites et des tétrahydrobioptérines similaires, indépendamment du M-CSF et du GM-CSF, ou LCM. Mais les niveaux de bioptérine totale étaient plus élevés dans les milieux supplémentés en LCM.
Cependant, une plus grande variabilité entre les différents lots de LCM a été observée. La PCR a montré un produit de paire de base 1030 chez des souris de type sauvage, tandis que les souris knockout GCH ont produit un produit de paire de base 1392, confirmant l’excision des exons critiques. Le traitement au tamoxifène a aboli la protéine GCH dans les cellules knockout.
Les cellules knock-out et de contrôle produisaient toujours de l’iNOS, après la stimulation du LPS et de l’IFN. Les BMDM cultivés à partir de souris knockout GCH conditionnelles présentaient une diminution significative de la tétrahydrobioptérine et une diminution du nitrite. Les mêmes cellules cultivées dans des milieux LCM n’avaient pas d’expression de GCH1.
Cependant, les cellules produisent des quantités importantes de tétrahydrobioptérine et de nitrite après l’élimination. Le huitième jour, il n’y avait pas de différences significatives de morphologie entre les BMDM témoins non activés et les BMDM knockout GCH à différentes concentrations de tamoxifène. Les BMDM présentent les caractéristiques attendues des macrophages non stimulés, avec des cellules adhérentes rondes et des extrémités allongées.
Lorsque vous travaillez avec une cellule primaire comme celle-ci, il est impératif de stériliser soigneusement tous les tissus et l’équipement. De plus, le choix du bon milieu et du bon supplément est important pour maintenir un environnement à faible teneur en oxyde nitrique et en BH4. Les granulés et les milieux cellulaires peuvent être utilisés pour diverses applications en aval, en mettant l’accent sur le rôle de l’oxyde nitrique, de la bioptérine ou de l’état redox cellulaire.
Il peut inclure HPLC, qPCR et Western blot, entre autres.
