Этот протокол помогает в культивировании макрофагов, полученных из костного мозга у мышей с дефицитом iNOS или BH4, используя тщательно определенные среды и сыворотку с низким уровнем BH4 и нитратов, чтобы избежать вмешательства в окислительно-восстановительные механизмы. Тщательно контролируя уровни потенциальных загрязняющих веществ в процессе культивирования, мы можем ограничить интерференцию оксида азота, обеспечивая точность и воспроизводимость модельной системы. Этот метод позволяет проводить точные измерения биоптеринов, оксида азота и любых последующих факторов, связанных с этими важными соединениями.
Продемонстрировать процедуру будет доктор Томас Никол, постдокторант из нашей лаборатории. Для начала поместите ноги в 70% этанол на две минуты, чтобы смыть мех или остатки. Затем перенесите ноги в чистую, стерильную бактериологическую чашку Петри.
Аккуратно соскоблите по длине кости лезвием, разрезая сухожилия и удаляя мышцу из кости. Как только кости будут очищены от мышц, прорежьте эпифиз в верхней части большеберцовой кости, чуть ниже колена. Большеберцовая кость может быть разрезана на нижнем конце, чуть выше пересечения с малоберцовой костью.
Наконец, прорежьте эпифиз на обоих концах бедренной кости, недалеко от коленного и тазобедренного суставов. Чтобы промыть костный мозг, заполните 10-миллилитровый шприц 10 миллилитрами PBS и прикрепите его к игле. Затем вставьте иглу в медуллярную полость кости.
Осторожно промыть от одного до двух миллилитров PBS, проводя иглу вверх и вниз. Затем втяните подвеску пять-десять раз внутрь и из одного миллилитра шприца для дезагрегирования. Соберите суспензию в шприц в один миллилитр и пропустите ее через 70-микрометровый клеточный сетчатый фильтр в чистую 50-миллилитровую центрифужную трубку.
Наконец, поместите образцы на лед. Чтобы заморозить костный мозг для последующего использования, центрифугируют клетки при 1000 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте красную гранулу в двух миллилитрах антифриза.
Затем высиживают его при температуре 80 градусов по Цельсию в течение ночи. При замерзании разморозьте суспензию быстро при 37 градусах Цельсия. Переложите клеточную суспензию в чистую стерильную трубку, содержащую три миллилитра среды DMEM/F-12.
Далее гранулируют клетки центрифугированием. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в трех миллилитрах подготовленной среды DMEM/F-12. Подсчитайте ячейки и обложите их пластиковой посудой без TC в подготовленной среде DMEM/F-12.
Затем инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. На пятый день кормите клетки, добавляя 50% от первоначального объема среды DMEM/F-12. На шестой день стимулируют клетки, добавляя приготовленный GM-CSF до конечной концентрации 50 нанограмм на микролитр непосредственно в среду клеточной культуры.
На седьмой день удалите все медиа из клеток. Затем ненадолго промыть клетки предварительно подогретым PBS и добавить среду DMEM/F-12, содержащую 2% нижнего эндотоксина FBS, 1X пенициллин или стрептомицин, L-глутамин, 25 нанограммов на микролитр M-CSF и 50 нанограммов на микролитр GM-CSF. Наконец, инкубируйте клетки в течение ночи в среде, чтобы активировать макрофаги до фенотипа M0.
Для фенотипа M1 стимулируйте клетки 100 нанограммами на микролитр LPS и 10 нанограммами на микролитр IFN-гамма. Для фенотипа M2 стимулируйте клетки 100 нанограммами на микролитр IL-4. Инкубируйте клетки в течение ночи.
На восьмой день клетки готовы к сбору урожая или последующей обработке в соответствии с потребностями исследователя. Среды, дополненные 10% FBS, имели аналогичные нитриты и тетрагидробиоптерины, независимо от M-CSF и GM-CSF или LCM. Но общие уровни биоптерина были выше в средах, дополненных LCM.
Однако наблюдалась большая изменчивость между различными партиями LCM. ПЦР показала продукт 1030 пар оснований у мышей дикого типа, в то время как нокаутирующие мыши GCH произвели продукт 1392 пары оснований, подтверждающий иссечение критических экзонов. Лечение тамоксифеном отменило белок GCH в нокаут-клетках.
Нокаутирующие и контрольные клетки по-прежнему продуцировали iNOS после стимуляции LPS и IFN. БМДМ, культивируемые у условных нокаутирующих мышей GCH, демонстрировали значительное снижение тетрагидробиоптерина и снижение уровня нитритов. Те же клетки, культивируемые в среде LCM, не имели экспрессии GCH1.
Тем не менее, клетки производят значительное количество тетрагидробиоптерина и нитрита после нокаута. На восьмой день не было выявлено существенных различий в морфологии между неактивированным контролем и нокаутирующими БМДМ ГКГ при разных концентрациях тамоксифена. БМДМ демонстрируют особенности, ожидаемые от нестимулированных макрофагов, с круглыми адгезивными клетками и удлиненными конечностями.
При работе с первичными клетками, подобными этой, крайне важно тщательно стерилизовать все ткани и оборудование. Кроме того, выбор правильной среды и добавки важен для поддержания низкого уровня оксида азота и среды BH4. Клеточные гранулы и среды могут быть использованы для различных последующих применений, с акцентом на роль оксида азота, биоптерина или клеточного окислительно-восстановительного состояния.
Он может включать в себя ВЭЖХ, qPCR и вестерн-блот, среди прочего.
