脊髄内の異なる細胞によるsEvとも呼ばれる小さな細胞外小胞の取り込みも視覚化することで、sEVの正常な送達を確認できる。これにより、ローデンモデルの様々なソースから、子宮内投与されたsEvの機械学的および治療的研究が可能になります。このプロトコルは、軽度の脊髄内の細胞によるsEV取り込みを視覚化するために使用することができ、脊髄障害、痛みおよび炎症におけるsEVとその貨物分子の役割を評価するのに役立ちます。
この手順は、私が、スアン・ルオ・ア・nd・ジュチェン・リン博士の研究室の2人の大学院生と共に実証されます。12ウェルプレートに18ミリメートルのカバースリップを入れてから始め、10%FBSと1%ペンストレップを含む完全なDMEMの合計1ミリリットルで各ウェルにニューロ2a細胞をプレートします。細胞数の流暢度が80〜90%に達すると、各ウェルのDMEMエキソソーム枯渇培地に培地を変更し、標識されたSEVの1、5または10マイクログラムを追加します。
1時間、4時間、24時間。色素制御の等容積でウェルの残りの部分への用量および時間依存の取り込みのため。60ミリメートルで出生後の子犬の脳を収集し、氷冷ハンクスバランス塩溶液を含むペトリ皿は、10ミリモルヘップを補い、皮質葉の両方を解剖し、髄歯を取り除きます。
その後、殺菌されたブレードで組織をミンチします。ペパネまたはデオキシリボ核1つの解離バッファーを含む15ミリリットルの円錐管に組織を移し、摂氏37度で20分間インキュベートし、5分ごとにチューブを渦巻き、上清を吸引し、5ミリリットルの完全なDMEMをチューブに加えます。酵素活性を不活性化するには、5ミリリットルガラス血清ピペットと炎磨き牧草地ピペットで組織を解化するために慎重に評価してみてください。
細胞懸濁液を40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通し、250倍Gの細胞を摂氏4度で5分間遠心分離し、培地を吸引し、75平方センチメートルのフラスコで完全なDMEMの10ミリリットルの細胞を見る。めっきの4時間後、上天性および培地を15ミリリットルの新鮮なDMEM培地に交換してください。ビトロで14日後にミクログリアとオリゴデンドロサイトを取り外し、フラスコを320RPMで6時間軌道シェーカーに移す。
5ミリリットルの細胞解離酵素を摂氏37度で10分間使用してください。トリップインするには、残りのアストロサイトを、酵素作用を不活性化するために、5ミリリットルの完全なDMEMを加え、250倍Gで細胞を4°Cで5分間ペレットする。完全なDMEMで細胞を再懸濁し、24ウェルプレートの12ミリメートル番号1.5カバースリップのセルを見ます。
PBSを使用して細胞を3回リンスし、室温で10分間PBSで4%のパワーホルムアルデヒドまたはPFAでそれらを固定します。固い細胞をPBSで5分間3回洗浄し、PBSで0.1%トリトンX 100を10〜15分間透過させます。その後、PBSでの使用を繰り返します。
PBSで5%正常ヤギ血清またはNGSを室温で1時間使用して細胞をブロックし、GFAP抗体を用いたニューロ-2a細胞とGFAP抗体の一次アストロサイトを、新鮮な5%NGSで1〜500比または穏やかな揺れを伴う摂氏4度のPBSで一晩インキュベートする。細胞をPBSで3回洗浄した後、5%NGSにフルオロフォア共役二次抗体を加える。ロッカーの光から保護された室温で2時間インキュベートします。
PBSで洗浄を繰り返し、室温で10分間、DAPIの1ミリリットルあたり1マイクログラムで細胞をインキュベートします。もう一度、PBSで細胞を3回洗います。アンチフェードマウント媒体を使用して、カバースリップをナンバー1スライドに取り付け、暗闇の中で一晩乾燥させ、コンフォーカル顕微鏡でイメージングするまで準備されたガラススライドを摂氏4度で保存します。
脊髄を解剖し、24時間摂氏4度でPBSで4%PFAに固定します。前にPBSで30%スクロースの組織を24時間、または組織が沈むまで摂氏4度で保存し、免疫組織化学になるまで摂氏4度で保存し、Oct化合物でL4 L5脊髄を浸透させ、完全に固まるまでドライアイスで凍結する前に行う。クライオスタットを使用して30マイクロメートルで組織を切り離し、PBSを含む24ウェルプレートにセクションを収集します。
セクションをPBSで0.3%トリトンでそれぞれ5分間3回洗浄し、室温で2時間0.3%トリトンPBSで5%MGSを使用して非特異的結合部位をブロックします。シェーカーで摂氏4度で一晩セクションをインキュベートします。セクションをPbsで0.3%トリトンで5分間3回洗浄します。
次に、二次抗体の適切な濃度を加える。テキスト原稿によると、室温で2時間インキュベートし、PBSのみを使用して切片を洗浄し、室温で10分間、DAPIの1ミリリットルあたり1マイクログラムでインキュベートする。次に、PBSを軽顕微鏡で繰り返し、細かいペイントブラシで透明な粘着スライドにセクションを取り付けます。
取り付け媒体でカバースリップを湿らせ、室温で暗闇の中で一晩硬化し、それぞれのレーザーで共焦点顕微鏡下で画像を取得し、RA2 6 4 0.7誘導sEVの平均平均サイズは140ナノメートルであり、ピーク粒子径は121.8ナノメートルであった。エキソソームまたはsEVSのサイズ範囲内に入る最も検出可能な粒子と。50~150ナノメートルで、sEv、細胞リサートおよびエキゾ枯渇した培地のウェスタンブロッティングは、sEV由来タンパク質サンプルにsEVマーカータンパク質Alix CD81およびGAPDHが含まれていることを実証した。
細胞リセートを小胞体で濃縮し、居住タンパク質カルネキシンはこのようにカルネキシンは、sEVに存在しなかった細胞汚染の陰性マーカーとして機能した。sEvの取り込みは1時間で起こり、1、5、10マイクログラムのsEVでは、4時間、4、5、10マイクログラムのsEvで蛍光後を検出できることが観察された。第一次アストロサイトによるPKH26標識sEvの取り込みを検討し、PKH26標識sEVが24時間に起こり、6時間で最大蛍光が観察され、注射後の細胞アストロサイトおよびミクログリア細胞におけるsEVから最大蛍光が生じた。
コントロール、ラベルなしのSEV、染料を含めることで、アンバウンド染料パッチコーストのOpry danceの特定のラベリングにより、最近の風偽陽性信号にコードを作成します。seVの取り込みは、レシピや細胞、組織への生体分子貨物の移動を調査し、生体分子や標的遺伝子の発現レベルの変化を決定することによって確認することができます。行動研究も行い、sEV送達の機能的影響を調べることができる。
