マイクロ流体デバイスを用いたsiRNA搭載脂質ナノ粒子の製造

脂質ナノ粒子サイズは、生体分布、抗腫瘍効果、および遺伝子サイレンシング性能に影響を及ぼす。したがって、LNPサイズ制御法は、RNA送達系を含むナノ医薬品を製造するための有効な技術である。iLiNPデバイスと名付けられたこのオリジナルのマイクロ流体デバイスは、10ナノメートル間隔で20〜100ナノメートルの範囲のLNPサイズを制御することができました。

iLiNPデバイスは、siRNA搭載LNPだけでなく、すべてのmRNA搭載LNPS、およびリボヌクレオタンパク質搭載LNPも産生することができる。まず、脂質エタノール溶液を採取し、DOTAP、DSPC、コレステロールおよびDMG-PEG2k溶液を50〜10〜38.5〜1.5のモル比で混合することによってsiRNA負荷LNPを生成する。総脂質濃度を8ミリモルに調整する。

次いで、pH4で154ミリモルの生理食塩水および25ミリモルの酢酸緩衝液の水溶液を採取し、0.2マイクロメートルのメンブレンフィルターまたはシリンジフィルターを通して濾過する。70マイクログラムのsiGL4を1ミリリットルの25ミリモル酢酸緩衝液に溶解してsiRNA緩衝液を調製する。1ミリリットルのガラスシリンジにそれぞれ脂質および水溶液を充填する。

シリンジコネクタを使用してガラスシリンジをピークキャピラリスに接続し、脂質および水溶液の流量を設定し、シリンジポンプを使用して脂質および水溶液を別々にiLiNP装置に導入する。LNP懸濁液をiLiNP装置の出口からマイクロチューブに集める。LNP懸濁液を、それぞれPOPC LNPsおよびsiRNA搭載LNPsについて生理食塩水またはDPBSに対して摂氏4度で分画分子量12〜14キロダルトンの透析膜を用いて一晩透析する。

透析したLNP懸濁液をマイクロチューブに集め、次にLNP懸濁液20〜30マイクロリットルをマイクロ石英セルにピペットする。最後に、動的光散乱によりLNPサイズ、LNPサイズ分布およびポリ分散度指数を測定する。総流量や流量比などの異なる流量条件で生成されたPOPC LNPサイズ分布がここに示されています。

このiLiNPデバイスを使用して、20~100ナノメートルの範囲の正確なLNPサイズを制御できます。小型LNPは、高い総流量条件で形成されます。さらに、FRR 5で形成されるLNPサイズは、総流量に関係なく、FRR 3のサイズよりも小さくなります。

siRNA搭載LNPsのサイズ分布をここに示す。siRNAは、カチオン性脂質DOTAPと負に荷電したsiRNAとの間の静電相互作用によってLNPに封入される。iLiNPデバイスは、狭い分布を有する90ナノメートルのsiRNAを装填したカチオン性LNPを産生した。

siRNAの封入効率は、カチオン性脂質と負に荷電したsiRNAとの間の静電相互作用のために95%であった。19ナノメートルsiRNA搭載LNPsの細胞毒性および遺伝子サイレンシング活性を評価した。siRNA負荷LNPsは、10〜100ナノモルのsiRNAの用量で細胞毒性を示した。

ルシフェラーゼの発現量はsiRNA濃度に依存して減少した。LNPsをロードしたsiRNAは、100ナノモルのsiRNAの用量で80%のルシフェラーゼ発現を抑制した。流れ条件の最適化は、所望のサイズのLNPを得るためのプロトコルの最も重要なステップです。

iLiNP装置を含むマイクロ流体ベースのLNP製造方法は、煩雑な手順を必要とせず、標準的なLNP製造方法として採用されることが期待されています。