現在のプロトコルは、研究者がsiRNAを搭載したナノ粒子を産生し、これらのナノ粒子を適切に特徴付け、その後の研究の前に動物に投与するための適合性を確保することができるため、重要である。このアプローチの利点は、siRNAのバイオアベイラビリティを高めるナノ粒子を生成し、中立的に荷電され、全身投与に適したナノ粒子を生成することである。この技術は、siRNAナノ粒子が癌、心血管疾患、自己免疫疾患などの全身投与を必要とする無数の疾患を治療するために適用することができるので、インパクトがあります。
まず、ポリマーを1ミリリットル当たり33.3ミリグラムの濃度でエタノールに溶解し、溶解を確実にするために攪拌する。その後、ピペットを使用してポリマー溶液を10ミリモルクエン酸バッファーに移し、1ミリリットル当たり3.33ミリグラムの濃度に達します。蒸留水を小さな干渉RNAを含むチューブに加え、50マイクロモル濃度を達成します。
ポリマーと小さな干渉RNA溶液をチューブに完全に混ぜ合わせ、上下にピペット加工して窒素対リン酸比10を達成します。チューブを周囲温度で30分間置きます。次に、pH 8で10ミリモルリン酸緩衝液1ミリリットルをチューブに加えて、1ミリリットル当たり0.28ミリグラムの濃度を達成し、チューブをピペットまたは反転させることで穏やかに混ぜます。
最終的なpHが中性であることを確認するために、7.2〜7.5の周りに、pH試験ストリップ上に小さな干渉RNAナノ粒子溶液のピペット10マイクロリットル。まず、0.45マイクロメートルの細孔サイズシリンジフィルターを通して、1ミリリットル当たり0.28ミリグラムの濃度で小さな干渉RNAナノ粒子の1ミリリットルを正方形のクォーツまたはポリスチレンキュベットに濾過して、動的光散乱サンプルを調製します。その後、メーカーの仕様に従って動的光散乱計を使用して、サイズと表面電荷の測定を記録します。
透過型電子顕微鏡を用いた小さな干渉RNAナノ粒子の大きさと形態を確認するために、まず、各TEMグリッドに1ミリリットル当たり0.28ミリグラムで濾過された小さな干渉RNAナノ粒子溶液の5マイクロリットルを各TEMグリッドに加える。周囲温度で60秒間グリッドを配置します。フィルターペーパーで3秒間乾燥させます。
次に、3%のウラニル酢酸溶液を5マイクロリットルずつ各グリッドに加え、20秒間インキュベートします。ブロットは3秒間乾燥します。次に、透過型電子顕微鏡の下でイメージングする前に、一晩乾燥するためにデシケータにグリッドを置きます。
アガロースゲル遅滞を行うために、まず2グラムの電気泳動グレードのアガロース粉末をビーカー中のpH 8で1Xトリス酢酸-EDTAバッファーの100ミリリットルに2グラム加え、2%アガロースゲルを生成する。アガロースを中断するためにかき混ぜます。電子レンジで覆われたビーカーを置き、すべてのアガロースが溶解するまで1〜3分間加熱します。
冷却したら、1ミリリットル当たり10ミリグラムの濃度で臭化エチジウムを5マイクロリットル加えてビーカーによく混ぜます。その後、アガロースをゲルトレイに注ぎ、櫛を置いて井戸を作ります。ゲルを30分間乾燥させます。
慎重に負荷ウェルの後ろに残すために櫛を取り外し、最大充填ラインに充填するためにゲルトレイに1Xトリス酢酸-EDTAバッファーを注ぎます。次に、異なる窒素対リン酸比で各小さな干渉RNAナノ粒子製剤に対して、SDSを伴う負荷染料または還元剤をパラフィンフィルムに2マイクロリットルのアリコートを配置する。ピペットは、パラフィンフィルム上の負荷染料と小さな干渉RNAナノ粒子溶液の10マイクロリットルを混合する。
アガロースゲルウェルに混合物を追加します。電気泳動システムを電源に差し込み、電圧源を100ボルトで35分間、またはサンプルがゲル長の80%を通過するまで実行します。トレイからUVトランイルミネータにゲルを移し、メーカーの仕様に従ってUVトランイルミネーターの小さな干渉RNAバンドを視覚化します。
ゲルの底部にある小さな干渉RNAバンドの消失に基づいて、最適な窒素対リン酸比を決定します。モデル遺伝子ルシメラーゼをノックダウンするために、最初の種子ルシファーゼ発現細胞は、1ウェルあたり2,000細胞の密度で10%FBSのDMEMを有する96ウェル黒壁プレートに含まれる。プレートをインキュベーターに一晩入れ、細胞が付着できるようにします。
朝、培地を取り除き、100ナノモルの最終的な小さな干渉RNA濃度のために完全な血清媒体に希釈された小さな干渉RNAナノ粒子のウェルあたり10マイクロリットルを加えます。ウェルをインキュベーターに24時間戻し、細胞を小さな干渉RNAナノ粒子で処理します。翌日、1ミリリットルのD-ルシフェリンあたり150マイクログラムを含む完全な血清培地にメディアを交換してください。
プレートリーダーで発光を測定する前に、室温で5分間細胞をインキュベートします。その後、D-ルシフェリンを含まない新鮮なフル血清培地でメディアリフレッシュを2回繰り返し、続いて24時間インキュベーションを行います。1ミリリットルのD-ルシフェリンあたり150ミリグラムを含む完全な血清培地でメディアを交換し、室温で5分間インキュベートします。
48時間の時点で発光を測定します。縦方向の研究のために、生体安全キャビネットの外側にウェルプレートの上に蓋をして、無菌状態で細胞を維持し、ルシフェリン含有培地を新鮮な完全培地に置き換えた後もインキュベーションを継続します。動的光散乱測定は、小さな干渉RNAナノ粒子1が平均直径35ナノメートルであることを示している。
狭いピーク幅を持つ単一のピークの存在は、単一の分布と低い多分散性を示します。TEM測定は、動的光散乱からのサイズ測定を確認し、小さな干渉RNAナノ粒子の均一な集団の存在を示唆し、小さな干渉RNAナノ粒子の球形形態を明らかにした。調製工程におけるポリマーの濃度が高すぎると、200ナノメートルを超える望ましくない直径の小さな干渉RNAナノ粒子2、マルチモーダルおよび多分散集団、および溶液中の凝集体が明確な粒子形態を形成しない結果となった。
小さな干渉RNAナノ粒子1と2の両方のディスプレイ中性表面電荷は、ほぼゼロ平均ゼータ電位値で示される。アガロースゲル位相引きアッセイは、ゲル底部における小さな干渉RNAバンドの消失を示しており、ポリマーへの微小干渉RNAの錯体を示す。ポリマー複合体小さな干渉RNAはゲルを通って移動することができず、したがってローディングウェルの近くのゲルの上部で視覚化されます。
窒素対リン酸比が増加するにつれて、ゲル底部の小さな干渉RNAバンドの強度低下によって示されるように、微小な干渉RNA錯体が増加する。生物活性ルシメラーゼは、小さな干渉RNAナノ粒子1は、スクランブル制御と比較して、ルシメラーゼ活性を有意に低下させる。これに対し、ルシメラーゼは小さな干渉RNAナノ粒子2は生理活性とはみなされない。
所望の物理化学的特性を有する一貫したsiRNAナノ粒子を製造するためには、適切な濃度のポリマー溶液を使用し、プロトコルの各ステップで緩衝液のpHを検証する必要があります。我々の研究では、これらの方法を用いて、これまで薬物を飲み込めていなかった癌を引き起こす遺伝子に対するsiRNAナノ粒子ベースの治療法を製造し、乳癌の前臨床モデルにおけるこれらの治療法の有効性をテストすることができました。
