تسمح هذه الطريقة بالتحقيق في كيفية تأثر حالة أكسدة الميتوكوندريا في الحالات المرضية الفسيولوجية. ويمكن استخدامه أيضا لتقييم فعالية استراتيجيات العلاج التي تهدف إلى حماية الميتوكوندريا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لجهاز وتقييم محدد للتغيرات الديناميكية والتتبع على حالة أكسدة الميتوكوندريا في الوقت الحقيقي.
يمكن الجمع بين هذه الطريقة مع مؤشرات إضافية لتسجيل في وقت واحد، على سبيل المثال، غشاء الميتوكوندريا المحتملة أو تركيزات الكالسيوم بالإضافة إلى حالة الأكسدة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على خلايا الاستزراع، ونباتات الأنسجة، وشرائح الثقافات. ابدأ بتحسين إعدادات المجهر البؤري المسح الضوئي.
للقيام بذلك، قم بتعيين الكاشف إلى 12 بت أو 16 بت، وقم بتنشيط وضع المسح التسلسلي وإضافة تسلسل/مسار ثان. لكلا القناتين، حدد جدول بحث زائف للألوان يشير إلى البيكسلات فوق البكسلات التي تم تعريضها بشكل ناقص ثم حدد هدفا مناسبا للهدف محل الاهتمام. جبل غطاء مع الخلايا في غرفة التصوير.
أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتصوير وضع الغرفة على المجهر. استخدام العدسة والضوء المنقول لتركيز الخلايا. تسجيل الصور بتنسيقات بكسل مختلفة وأحجام الثقب.
ثم تسجيل الصور مع كثافة الليزر المختلفة، وبالتالي ضبط كسب كاشف والعتبة. وأخيرا، سجل الصور بسرعات مسح مختلفة وأعداد مختلفة من متوسطات الإطارات. للتصوير الحي، قم بتعيين الفاصل الزمني الفاصل الزمني إلى 30 ثانية والمدة إلى 25 دقيقة.
ثم تركيب الخلايا، ووضع الغرفة على المجهر وتركيز الخلايا كما هو موضح سابقا. قم بالتبديل إلى وضع المسح الضوئي واستخدم قناة 488 نانومتر في المنظر المباشر للتركيز وتحديد موقع الخلايا للتصوير. اختياريا، لزيادة عدد الخلايا المسجلة لكل تشغيل، استخدم الدالة متعددة النقاط لصورة حقلين إلى ثلاثة حقول للعرض لكل غطاء.
ابدأ عملية الحصول على الفاصل الزمني وسجل خمس صور كتسجيل أساسي لمدة دقيقتين. إضافة 500 ميكرولتر من حل NMDA 3X إلى الغرفة لتحقيق التركيز النهائي من 30 ميكرومولار وتسجيل 20 صورة إضافية كاستجابة NMDA لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من حل 4X DA إلى الغرفة وسجل ست صور أخرى.
يستنشق المخزن المؤقت من غرفة التصوير ويستبدله بمليلتر واحد من محلول DTT. بعد تسجيل 10 صور أخرى، قم بإنهاء التسجيل وحفظ سلسلة الصور. لاستيراد البيانات في برنامج تحليل الصور ، انقر على الإضافات ، حدد الأشكال الحيوية ، ثم تنسيقات الحيوي المستورد.
في مربع الحوار، اختر hyperstack في مكدس العرض مع، ثم قم بتعيين وضع اللون كإعداد افتراضي وحدد المقياس التلقائي. تغيير تنسيق الصورة إلى 32 بت عن طريق النقر على الصورة، وتحديد نوع، ومن ثم من الخيارات، اختر 32 بت. لتقسيم قنوات الألوان إلى نوافذ منفصلة، انقر على الصورة، انتقل إلى اللون، وحدد تقسيم القنوات.
ضبط عتبة لتحديد الميتوكوندريا للتحليل عن طريق النقر على الصورة، واختيار ضبط والعتبة. في مربع الحوار، حدد الخلفية الداكنة الحمراء الافتراضية وتكدس الرسم البياني. عندما تظهر البيكسلات المحددة باللون الأحمر، انقر فوق تطبيق.
ثم حدد تعيين وحدات بكسل الخلفية إلى NAN معالجة كافة الصور وتنفيذ نفس الإجراء للقناة الثانية. لتصور نسبة 405 إلى 488 نانومتر، إنشاء صورة نسبة عن طريق النقر على عملية وآلة حاسبة الصورة. في مربع الحوار، حدد القناة الأولى في صورة واحدة قسمة في قناة العملية الثانية في الصورة الثانية.
ثم حدد إنشاء نافذة جديدة ومعالجة جميع الصور. تغيير جدول البحث عن صورة النسبة إلى اللون الزائف بالنقر فوق الصورة، وتحديد جداول البحث، ثم إطلاق النار. لتحليل الصورة، رسم ROIs حول الخلايا الفردية أو الميتوكوندريا على صورة النسبة.
لإضافة عائد الاستثمار إلى مدير عائد الاستثمار، انتقل إلى التحليل، انقر على الأدوات، حدد مدير عائد الاستثمار، انقر على إضافة وحدد إظهار كل شيء. لقياس نسب 405 إلى 488 نانومتر من الخلايا الفردية، انقر على مدير عائد الاستثمار، حدد جميع ROIs عن طريق الضغط على Control A، انتقل إلى أكثر وحدد multi-measure. في مربع الحوار، حدد قياس كافة الشرائح والصف الواحد لكل شريحة.
بعد تصدير القياسات إلى برنامج جدول البيانات، حدد صورة 405 نانومتر، وقياس كثافة جميع ROIs، ومرة أخرى تصدير القياسات إلى برنامج جدول البيانات. وبالمثل، قم بقياس كثافة عائد الاستثمار لصورة 488 نانومتر. لحفظ ROIs للرجوع إليها في المستقبل، حدد كافة ROIs بالضغط على Control A، ثم انتقل إلى المزيد وحدد حفظ.
هذه اللقطات التمثيلية من تسجيل الفاصل الزمني تظهر صور نسبة الخلايا العصبية قبل وبعد العلاج NMDA وبعد معايرة ماكس / دقيقة مع DA و DTT. علاج الخلايا العصبية مع 30 nmDA ميكرومولار المستحثة أكسدة الميتوكوندريا في غضون بضع دقائق. وكشف تحليل القنوات الفلورية الفردية أن حمض الميتوكوندريا الناجم عن NMDA تسبب في انخفاض مضان GFP على كل من 405 و 488 نانومتر من الإثارة.
في تجربة التحكم ، حال العلاج المسبق مع DA دون أي أكسدة الميتوكوندريا الأخرى من قبل NMDA. وبناء على ذلك، فإن نسبة 405 إلى 488 لم تتغير على الرغم من إخماد كبير لكثافة الفلورية GFP2 الحساسة للأكسدة. وأكدت هذه التجربة أن نسبة 405 إلى 488 نانومتر لا تتأثر بالتغيرات في الحموضة.
في تجربة منفصلة ، تم تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وحالة الأكسدة ، ومورفولوجيا بالتوازي. علاج الخلايا العصبية مع 60 NMDA ميكرومولار أدى إلى فقدان رباعي ميثيلرهودامين أو إشارة TMRE وزيادة في 405 إلى 488 نانومتر rho GFP نسبة تليها بعض التقريب تأخر الميتوكوندريا. عند البدء في استخدام هذه الطريقة، من المهم جدا أن تأخذ بعض الوقت لتحسين الإعدادات المجهرية بعناية.
وهذا سوف يساعد على الحفاظ على صحة الخلايا العصبية أثناء التجارب الخاصة بك. من المهم جدا أيضا احترام قواعد السلامة بالليزر دائما. تأكد من عدم التعرض لإشعاع الليزر عند إضافة أدوية للعبث بها أثناء التسجيلات المباشرة.
