Bu yöntem, mitokondriyal redoks durumunun patofizyolojik koşullarda nasıl etkilendiğini araştırmayı sağlar. Mitokondrileri korumayı amaçlayan tedavi stratejilerinin etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mitokondri redoks durumundaki dinamik ve izleme değişikliklerinin gerçek zamanlı olarak bir organ ve spesifik değerlendirmesine izin ver olmasıdır.
Bu yöntem, redoks durumuna ek olarak mitokondriyal membran potansiyelini veya kalsiyum konsantrasyonlarını aynı anda kaydetmek için ek göstergelerle birleştirilebilir. Bu protokol kültür hücrelerine, doku eksplantlarına ve dilim kültürlerine uygulanabilir. Tarama konfokal mikroskop ayarlarını optimize ederek başlayın.
Bunu yapmak için dedektörü 12 bit veya 16 bit olarak ayarlayın, sıralı tarama modunu etkinleştirin ve ikinci bir sıra/parça ekleyin. Her iki kanal için de, aşırı ve az pozlanmış pikselleri gösteren sahte bir renk arama tablosu seçin ve ardından ilgi çekici nesneye uygun bir hedef seçin. Görüntüleme odasına hücreli bir kapak kapağı takın.
Bir mililitre görüntüleme tamponu ekleyin ve odayı mikroskop üzerine yerleştirin. Hücreleri odaklamak için göz merceği ve iletilen ışığı kullanın. Farklı piksel formatları ve iğne deliği boyutlarıyla görüntüleri kaydedin.
Ardından farklı lazer yoğunluklarına sahip görüntüler kaydedin ve buna göre dedektör kazancını ve eşiğini ayarlayın. Son olarak, farklı tarama hızlarına ve farklı kare ortalamalarına sahip görüntüler kaydedin. Canlı görüntüleme için zaman çakışma aralığını 30 saniyeye ve süreyi 25 dakikaya ayarlayın.
Daha sonra hücreleri monte edin, odayı mikroskop üzerine yerleştirin ve hücreleri daha önce gösterildiği gibi odaklayın. Tarama moduna geçin ve görüntüleme hücrelerini odaklamak ve bulmak için canlı görünümdeki 488 nanometre kanalını kullanın. İsteğe bağlı olarak, çalışma başına kaydedilen hücre sayısını artırmak için, kapak altlığı başına iki ila üç görünüm alanını görüntülemek için çok noktalı işlevi kullanın.
Timelapse alımını başlatın ve beş görüntüyi iki dakikalık temel kayıt olarak kaydedin. 30 mikromolar son konsantrasyonu elde etmek için odaya 500 mikrolitre 3X NMDA çözeltisi ekleyin ve 10 dakikalık NMDA yanıtı olarak ek 20 görüntü kaydedin. Ardından, odaya 500 mikrolitre 4X DA çözeltisi ekleyin ve altı görüntü daha kaydedin.
Tamponu görüntüleme odasından epire edin ve bir mililitre DTT çözeltisi ile değiştirin. 10 resim daha kaydettikten sonra kaydı sonlandırın ve görüntü serisini kaydedin. Görüntü analiz yazılımındaki verileri içe aktarmak için eklentilere tıklayın, biyo formatları seçin ve ardından biyo formatları içe aktarıcı.
iletişim kutusunda, görünüm yığınında hipersack'i seçin, renk modunu varsayılan olarak ayarlayın ve otomatik ölçekle'yi seçin. Görüntüye tıklayarak, türü seçerek ve seçeneklerden 32 bit'i seçerek görüntü biçimini 32 bit olarak değiştirin. Renk kanallarını ayrı pencerelere bölmek için görüntüyü tıklatın, renge gidin ve bölünmüş kanalları seçin.
Görüntüyü tıklatarak, ayarla ve eşik'i seçerek analiz için mitokondriyi seçmek için eşiği ayarlayın. iletişim kutusunda, varsayılan kırmızı koyu arka planı seçin ve histogramı yığın. Seçili pikseller kırmızı göründüğünde Uygula'ya tıklayın.
Ardından, tüm görüntüleri NAN işlemek için arka plan piksellerini ayarla'yı seçin ve kanal iki için aynı yordamı uygulayın. 405 ila 488 nanometre oranını görselleştirmek için işlem ve görüntü hesaplayıcısına tıklayarak bir oran görüntüsü oluşturun. iletişim kutusunda, görüntüde bir kanal bir bölmeyi seçin, ikinci görüntüde ikinci işlem kanalında bölün.
Ardından yeni pencere oluştur'u seçin ve tüm görüntüleri işleyin. Görüntüyü tıklatıp arama tablolarını seçip ateş ederek oran görüntüsünün arama tablosunu sahte renge değiştirin. Görüntüyü analiz etmek için, tek tek hücrelerin etrafına RBI'ler veya oran görüntüsüne mitokondri çizin.
Roi'leri yatırım getirisi yöneticisine eklemek için analize gidin, araçlara tıklayın, yatırım getirisi yöneticisini seçin, ekle'ye tıklayın ve tümlerini göster'i seçin. Tek tek hücrelerin 405 ila 488 nanometre oranlarını ölçmek için yatırım getirisi yöneticisine tıklayın, Kontrol A tuşuna basarak tüm ROI'leri seçin, daha fazlasına gidin ve çok ölçülü seçin. iletişim kutusunda, tüm dilimleri ve her dilimde bir satırı ölç'ü seçin.
Ölçümleri elektronik tablo yazılımına dışa aktarmanın ardından, 405 nanometre görüntüsünü seçin, tüm ROI'lerin yoğunluklarını ölçün ve ölçümleri yine elektronik tablo yazılımına dışa aktarın. Benzer şekilde, 488 nanometre görüntüsünün yatırım getirisi yoğunluklarını ölçün. ROI'leri ileride başvurmak üzere kaydetmek için, A Denetimi'ne basarak tüm ROI'leri seçin, daha fazlasına gidin ve kaydet'i seçin.
Bir timelapse kaydından elde edilen bu temsili anlık görüntüler, NMDA tedavisinden önce ve sonra ve DA ve DTT ile maksimum / en az kalibrasyondan sonra nöronların oran görüntülerini gösterir. Nöronların birkaç dakika içinde 30 mikromoler NMDA indüklenmiş mitokondri oksidasyonu ile tedavisi. Bireysel floresan kanallarının analizi, NMDA kaynaklı mitokondriyal asidozun hem 405 hem de 488 nanometre eksize edicide bir damla GFP floresansına neden olduğunu ortaya koydu.
Bir kontrol deneyinde, DA ile ön işlem, NMDA tarafından daha fazla mitokondri oksidasyonunu önledi. Ve buna göre, 405 ila 488 oranı, redoksa duyarlı GFP2 floresan yoğunluğunun önemli ölçüde söndürülmesine rağmen değişmedi. Bu deney, 405 ila 488 nanometre oranının pH değişikliklerini etkilemediğini doğruladı.
Ayrı bir deneyde mitokondriyal membran potansiyeli, redoks durumu ve morfoloji paralel olarak değerlendirildi. Nöronların 60 mikromoler NMDA ile tedavisi tetrametrilrhodamin veya TMRE sinyalinin kaybına ve 405 ila 488 nanometre rho GFP oranında bir artışa ve ardından mitokondrilerin gecikmeli toplanmasına neden oldu. Bu yöntemi kullanmaya başladığınızda, mikroskobik ayarları dikkatlice optimize etmek için zaman ayırarak çok önemlidir.
Bu, deneyleriniz sırasında nöronların sağlıklı kalmasına yardımcı olacaktır. Lazer güvenlik kurallarına her zaman riayet etmek de çok önemlidir. Canlı kayıtlar sırasında kurcalamak için ilaç eklerken lazer radyasyona maruz kalmadığınızdan emin olun.
