Этот метод позволяет исследовать, как митохондриальное окислительно-восстановительное состояние влияет в патофизиологических условиях. Он также может быть использован для оценки эффективности стратегий лечения, направленных на защиту митохондрий. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет органу и специфическо оценивать динамические и прослеживающие изменения окислительно-восстановительного состояния митохондрий в режиме реального времени.
Этот способ можно комбинировать с дополнительными показателями для одновременной регистрации, например, потенциала митохондриальной мембраны или концентраций кальция в дополнение к окислительно-восстановительному состоянию. Этот протокол может быть применен к клеткам культивирования, тканевым эксплантам и культурам срезов. Начните с оптимизации настроек сканирующего конфокального микроскопа.
Для этого установите детектор на 12 бит или 16 бит, активируйте режим последовательного сканирования и добавьте вторую последовательность/трек. Для обоих каналов выберите таблицу подстановки псевдоцветов, которая показывает переэкспонированные и недоэкспонированные пиксели, а затем выберите объект, подходящий для интересующего объекта. Установите крышку с ячейками в камеру визуализации.
Добавьте один миллилитр буфера визуализации и поместите камеру на микроскоп. Используйте окуляр и пропускаемый свет, чтобы сфокусировать клетки. Записывайте изображения с различными форматами пикселей и размерами точечных отверстий.
Затем записывайте изображения с различной интенсивностью лазера и соответственно регулируйте коэффициент усиления и порог детектора. Наконец, записывайте изображения с разной скоростью сканирования и разным количеством средних кадров. Для изображения в реальном времени установите интервал замедленной съемки равным 30 секундам и продолжительность 25 минут.
Затем установите клетки, поместите камеру на микроскоп и сфокусируйте клетки, как было продемонстрировано ранее. Переключитесь в режим сканирования и используйте 488-нанометровый канал в режиме реального времени, чтобы сфокусировать и найти ячейки для визуализации. При необходимости, чтобы увеличить количество записываемых ячеек за прогон, используйте многоточечную функцию для отображения двух-трех полей зрения на облицовочный лист.
Начните сбор таймлапса и запишите пять изображений в качестве двухминутной базовой записи. Добавьте 500 микролитров раствора 3X NMDA в камеру для достижения конечной концентрации 30 микромоляров и запишите дополнительные 20 изображений в качестве 10-минутного NMDA-ответа. Затем добавьте 500 микролитров раствора 4X DA в камеру и запишите еще шесть изображений.
Аспирируйте буфер из камеры визуализации и замените его одним миллилитром раствора DTT. После записи еще 10 изображений завершите запись и сохраните серию изображений. Для импорта данных в программное обеспечение для анализа изображений нажмите на плагины, выберите биоформаты, а затем импортер биоформатов.
В диалоговом окне выберите гиперстек в стеке представлений, установите цветовой режим по умолчанию и выберите автоматическое масштабирование. Измените формат изображения на 32 бита, щелкнув по изображению, выбрав тип, а затем из параметров выберите 32 бита. Чтобы разделить цветовые каналы на отдельные окна, нажмите на изображение, перейдите к цвету и выберите разделенные каналы.
Отрегулируйте порог, чтобы выбрать митохондрии для анализа, нажав на изображение, выбрав корректировку и порог. В диалоговом окне выберите по умолчанию красный темный фон и гистограмму стека. Когда выбранные пикселы станут красными, нажмите «Применить».
Затем установите пиксели фона для обработки NAN всех изображений и выполните ту же процедуру для второго канала. Для визуализации соотношения 405 к 488 нанометрам создайте изображение соотношения, нажав на калькулятор процесса и изображения. В диалоговом окне выберите первый канал в изображении один деление в операционном канале два в изображении два.
Затем выберите создать новое окно и обработать все изображения. Измените таблицу подстановки изображения с соотношением цвета на псевдоцвет, щелкнув изображение, выбрав таблицы подстановки, а затем выстрелите. Для анализа изображения нарисуйте ROI вокруг отдельных клеток или митохондрий на изображении соотношения.
Чтобы добавить ROI в менеджер ROI, перейдите к анализу, нажмите на инструменты, выберите менеджер ROI, нажмите «Добавить» и выберите «Показать все». Чтобы измерить соотношение от 405 до 488 нанометров отдельных ячеек, нажмите на менеджер ROI, выберите все ROI, нажав Control A, перейдите к дополнительному и выберите многомерный. В диалоговом окне выберите Измерить все фрагменты и по одной строке на фрагмент.
После экспорта измерений в программное обеспечение для работы с электронными таблицами выберите 405-нанометровое изображение, измерьте интенсивность всех ROI и снова экспортируйте измерения в программное обеспечение для работы с электронными таблицами. Аналогичным образом измерьте интенсивность ROI 488-нанометрового изображения. Чтобы сохранить окупаемость инвестиций для дальнейшего использования, выберите все окупаемости инвестиций, нажав клавишу Control A, перейдите к разделу «Дополнительно» и нажмите кнопку «Сохранить».
Эти репрезентативные снимки из записи таймлапса показывают изображения соотношения нейронов до и после nmDA лечения и после максимальной / минимальной калибровки с DA и DTT. Обработка нейронов 30 микромолярной NMDA-индуцированной окислением митохондрий в течение нескольких минут. Анализ отдельных флуоресцентных каналов показал, что NMDA-индуцированный митохондриальный ацидоз вызывал падение флуоресценции GFP при возбуждении как на 405, так и на 488 нанометров.
В контрольном эксперименте предварительная обработка DA исключала дальнейшее окисление митохондрий NMDA. И, соответственно, соотношение 405 к 488 не изменилось, несмотря на значительное гашение окислительно-чувствительной интенсивности флуоресценции GFP2. Этот эксперимент подтвердил, что соотношение 405 к 488 нанометрам не зависит от изменений рН.
В отдельном эксперименте митохондриальный мембранный потенциал, окислительно-восстановительное состояние и морфология оценивались параллельно. Лечение нейронов с 60 микромолярной NMDA привело к потере сигнала тетраметилродамина или TMRE и увеличению соотношения GFP от 405 до 488 нанометров rho с последующим некоторым отсроченным округлением митохондрий. Когда вы начинаете использовать этот метод, очень важно уделить время тщательной оптимизации микроскопических настроек.
Это поможет сохранить нейроны здоровыми во время ваших экспериментов. Также очень важно всегда соблюдать правила безопасности лазера. Убедитесь, что вы не подвергаетесь воздействию лазерного излучения, когда вы добавляете лекарства для подделки во время живых записей.
