高純度のプラストグロビュールの単離は、彼らの研究にとって重要です。ここでは、下流の生化学的調査を容易にする、それらの分離のための迅速かつ効果的なプロトコルを紹介します。この方法の主な利点は、手順の相対的な速度と、多数の植物種および環境条件への適応性です。
チラコイドからプラストグロビュールを除去するのに十分な力を確保し、その後スクロース勾配からプラストグロビューを抽出するために、チラコイド再懸濁液を超音波処理する際に特別な注意を払う必要があります。この手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるエルシンラジュ・デヴァダス博士と、私の研究室の博士課程の学生であるフェブリ・スサント博士です。V5の成長段階を持ち、重さ約120グラムの6つの健康なトウモロコシの3週齢の苗を取得することから始めます。
茎の付け根にあるすべての葉を切り取り、氷浴にすばやく浸してから冷蔵室に運びます。緑色の安全ランプの下で作業し、氷浴からトウモロコシの葉を取り除き、はさみを使用してそれらを小さな5×5センチメートルの断片に切り取ります。クリップされた葉組織の半分を350ミリリットルの粉砕バッファーで、市販のブレンダーで7未満のレベルで穏やかかつ徹底的に粉砕します。
ブレンダーを5〜6回起動および停止して、すべての葉が確実にカットされるようにします。ホモジネートを大きな漏斗上の25ミクロンナイロン布の1層を通して4本の250ミリリットルの遠心分離機ボトルにろ過します。残りの切り取られた葉組織でブレンド工程を繰り返した後、濾液を4本のボトルの間で均等に分ける。
葉のろ液のアリコートを取り除き、代表的な総葉サンプルとして保存するために取っておきます。次に、ろ液を1, 840 Gおよび摂氏4度で6分間遠心分離する。得られた上清を注ぎ、ブラシを穏やかに旋回させながら、0.2モルのスクロースを含む12ミリリットルの培地R 0.2にペレットを再懸濁します。
ペレットを1本のボトルに再懸濁した後、懸濁液を次のボトルに追加し、再懸濁を繰り返して懸濁液を1本のボトルにプールします。プールされた懸濁液を6本の3ミリリットルの超遠心チューブに分配し、各チューブの最大容量2.5ミリリットルに達する。次に、100%の振幅でチップ超音波処理器を使用して、各チューブをそれぞれ10秒間4回超音波処理します。
泡立ちを防ぐために、超音波処理器ホーンを水没させ、液面から遠ざけてください。各ラウンド中にサスペンション内で超音波処理器ホーンをゆっくりと上下に動かします。4本のチューブを交互にしながら、各超音波処理後に各チューブをアイスバケットに戻し、サンプルを冷却します。
完了したら、超音波処理された粗チラコイド懸濁液を摂氏4度で30分間150, 000Gで遠心分離します。シリンジと22ゲージの針を使用してクッション表面をすくい取り、得られた黄色と油性の粗プラストグロビュールのフローティングパッドをショ糖クッションから採取します。各チューブから約500マイクロリットルを回収し、2.0ミリリットルのチューブに入れます。
プラストグロビュールの超音波処理と放出の前後に粗チラコイドアリコートを収集します。完了したら、植物組織の処理を続けるか、粗プラストグロビュールを摂氏マイナス80度で保管し、後で精製します。50ミリリットルのシネコシスチス種PCC 6802培養物をBG11培地で7〜10日間成長させて、固定期に到達します。
分光光度計を使用して、細胞密度を750ナノメートルで2.0の光学密度に調整します。多糖類を除去するには、50ミリリットルの培養液を遠心分離し、上清を除去する。50ミリリットルの緩衝液Aで細胞の洗浄を2回繰り返す。
洗浄したペレットを25ミリリットルの緩衝液Aに再懸濁し、1, 100ポンド平方インチのフレンチ圧力セルを使用して細胞を破砕する。白色光の下で溶解した色が緑から赤、青、緑に変わるまで、寒い条件でこのプロセスを3回繰り返します。細胞ホモジネートのアリコートを除去し、代表的な全細胞サンプルとして保存するために取っておきます。
得られたホモジネートを、各チューブに最大2.5ミリリットルまで充填された8本の3ミリリットルの超遠心チューブに分配します。このホモジネートを400マイクロリットルの培地Rと重ね合わせ、ステップグラジエントを生成します。チューブを遠心分離する前に、必要に応じて培地Rを追加して、チューブのバランスを慎重にとってください。
チラコイドおよびポリヒドロキシアルカノエート体を含む他のより重い細胞小器官はペレット形成を示し、プラストグロビュールはスクロース勾配の上部またはその近くに黄色の油性パッドを形成します。前に示したように、得られた粗プラストグロビュールのフローティングパッドを注射器で収穫し、収穫物を2ミリリットルのチューブに入れます。必要に応じて、針先で超遠心管壁の側面からプラストグロビュールをこすり落とします。
シアノバクテリアの処理を続けるか、粗プラストグロビュールを摂氏マイナス80度で保存し、後で精製します。植物組織処理法を用いて純粋なプラストグロビュールを収穫するには、500マイクロリットルの粗プラストグロビュール、400マイクロリットルの培地R 0.2、および400マイクロリットルの培地Rを用いて前述のスクロース勾配を調製し、遠心分離後、得られた純粋なプラストグロビュールのフローティングパッドを2ミリリットルのチューブに収穫する。純粋なプラストグロビュールを分注し、液体窒素でアリコートを瞬間凍結した後、摂氏マイナス80度で保管するか、凍結乾燥して乾燥粉末にします。
シアノバクテリアから純粋なプラストグロビュールを収穫するには、前述のように、500マイクロリットルの粗プラストグロビュール、750マイクロリットルの培地R 0.7、および750マイクロリットルの培地R 0.2を使用してスクロース勾配を作成します。遠心分離後、純粋なプラストグロビュールを1.5ミリリットルのチューブに集め、純粋なプラストグロビュールを分注します。完了したら、液体窒素でアリコートした純粋なプラストグロビュールを瞬間凍結し、摂氏マイナス80度で直接保管するか、凍結乾燥して乾燥粉末にします。
この方法では、かなりの量のプラストグロビュールまたは脂肪滴物質がスクロースクッションの最上層に浮遊しているのが見られた。その後の遠心分離後、スクロース勾配の表面またはその近くで精製プラストグロビュールが得られた。プラストグロビュールの単離に成功した後、シロイヌナズナフィブリリン1aおよびシロイヌナズナ光化学系IIサブユニットD1に対して産生された抗体を用いて純度評価のために開発されたイムノブロットは、フィブリリンホモログがプラストグロビュールよりもチラコイドと主に関連していることを示しました。
フローティングパッドを効率的かつ濃縮して抽出するには、シリンジニードルオリフィスを完全に水没させた状態でバッファーの液面のすぐ下に置き、ゆっくりと引き上げます。単離されたプラストグロビュールサンプルは、その後のプロテオミクスまたはリピドミクス研究に適しており、さまざまな環境条件下での標的タンパク質-脂質組成の変化を実証するために使用されています。この技術は、その後の生化学的調査を通じて、関連するプロテインキナーゼ活性の発見やオリゴマータンパク質複合体の存在など、プラストグロビュールの新しい研究を促進しました。
