トランスクリプトームレベルで遺伝子発現を特徴付けることは、健康および疾患における細胞機能を理解するための鍵です。我々の方法は、単一細胞および空間分解能でのトランスクリプトームプロファイリングのために、血管壁の重要な層である内皮細胞をヒトドナーのメネステリー動脈から捕捉することに焦点を当てている。選別工程のない血管からの内皮細胞の富化された集団があり、これは細胞損失を引き起こし得る。
さらに、組織コンテキストにおける細胞間相互作用の調査を可能にする他の細胞型が存在する。我々は、糖尿病および肥満の動脈変化を調査するためにこの技術を使用した。血管の利用可能性に応じて、これらの技術は、他の血管系および他の疾患における生物学を探索するために転用することもできる。
初めての場合は、2つの重要なステップが最も練習が必要です。1つは、より深い層を剥離することなく、一体型細胞を除去するために十分な力が加えられるべきであるが、掻き取りである。そして2つは、クライオスタットセクショニングです。
セクションが冷たく平らで、特殊なスライドの範囲内であることを確認します。手順を実演するのは、私の研究室の2人のポスドク研究者であるYingjun LuoとXiaofang Tangです。DPBSで組織を洗浄し始める。
滅菌鉗子と解剖ハサミで、血管がきれいになるまで脂肪と外側の結合組織を取り除きます。皿の外側に置かれた定規で船の長さを測定し、写真記録を撮ります。腸間膜動脈をハサミで縦に切断し、血管内腔を垂直に開く。
針を使用して、容器を四隅すべての黒いワックスに取り付け、内膜を露出させます。1ミリリットルの予め温めた消化バッファーを内膜に加える。滅菌メスを使用して、容器の内腔を2回静かにこすります。
消化バッファーをチューブに移す。内膜に1ミリリットルの消化バッファーを加え、慎重に上下にピペットして残りの細胞を集め、細胞懸濁液をチューブに移します。細胞を摂氏37度でインキュベーターまたはロッカーで5分間インキュベートする。
細胞懸濁液にM199培地を加えて酵素反応をクエンチし、穏やかに混合する。遠心分離終了時に懸濁液を摂氏4度および600倍 G.At 5分間遠心分離し、上清を別々に除去して保存し、培養物を対照として、全ての細胞がペレット中に捕捉されているか否かを観察した。次いで、細胞ペレットを1ミリリットルのM199培地に再懸濁する。
10マイクロリットルのトリパンブルーを10マイクロリットルの細胞ストックと混合することによって細胞生存率を評価する。細胞形態を観察し、血球計数器を用いて細胞を計数する。500マイクロリットルの付着試薬を室温で30分間ウェルにピすることによって、6ウェルプレートの2つのウェルをコーティングする。
ウェルを滅菌DPBSで洗浄した後、全細胞ストックを1つのウェルに分注し、上清を対照として第2ウェルに保持する。遠心分離機は、予め細胞ストックを摂氏4度および600倍Gで5分間調製した。上清を除去し、DPBS中の0.04%BSA中のP-1000ピペットでペレットを穏やかに再懸濁する。
単細胞懸濁液を確実にするためによく混合する。溶液を40マイクロメートルのストレーナーに通し、細胞破片を除去します。次いで、懸濁液を遠心分離し、実証したように上清を除去した。
P-1000ピペットを使用してペレットをDPBS中の0.04%BSAの500マイクロリットルに再懸濁し、よく混合して単一細胞懸濁液を確保します。以前に実証したように、トリパンブルーを用いて細胞生存率を評価する。血球計数器または自動細胞カウンターを使用して、単一細胞浮遊形態を観察し、組織破片をチェックし、生細胞および死細胞の数を計算する。
金属製キャニスターにイソペンタンを加えた後、液体窒素またはドライアイスで冷やします。OCT化合物をラベル付きプラスチッククライオモールドのウェルに注ぎ、気泡形成を防ぎます。ドライアイスにクライオ型を放置して冷やします。
容器の長さ1センチメートルの少なくとも2つの冠状部分を切断する。12インチの鉗子を使用して、凍結するまで組織をイソペンタンに沈める。中央に見える内腔の向きでOCTに組織をすばやく沈めます。
ドライアイスの上にクライオ カビをつかんで置き、凍結を観察します。OCTは1~2分で外から徐々に白くなります。これらのセクションは、マイナス80°Cの安全な容器に最大6ヶ月間保管してください。
チャンバーと試料ヘッドに必要なクライオスタット温度を設定します。OCT埋め込み容器のセクション、ナイフ、ブラシ、およびスライドをクライオスタット内でマイナス20°Cまで約30分間平衡化します。平衡化している間、機械とブレードを含むセクションに触れる可能性のあるすべての機器を70%エタノールで洗浄し、その後にRNase除染溶液を塗布します。
円形のクライオスタットブロックに少量のOCTを分配し、凍結する前にサンプルを上に置き、サンプルを取り付けます。ブロックを試料ヘッドの中央に配置した後、左側の背の高い黒いハンドルを使用してブロックを所定の位置にねじ込みます。船舶を取り囲む余分なOCTをカットします。
クライオスタット上で切断厚さを10マイクロメートルに設定し、約60個の切片を切断し、RNA抽出試薬を入れた予冷した1.5ミリリットルのチューブに入れる。断面が完全に溶解するまで渦巻き。テキスト原稿に記載されているようにRNAを抽出し、精製されたRNAペレットを5マイクロリットルのRNaseフリー水に溶解する。
アンチロールプレートを所定の位置に収めた状態で厚さ10マイクロメートルの断面を切断します。周囲の OCT を通してセクションを軽く触れて、反転して慎重に平らにします。スライドをエタノールで拭き取り、キャプチャ領域の裏側を指であらかじめ温めます。
RNaseフリーのクライオスタットブラシまたはスライドを直接使用して、周囲のOCTのみを使用して組織セクションを正方形内に配置します。すぐにキャプチャ領域の裏側に1本の指を置いて、セクションをスライドに溶かします。セクションが付着したら、スライドをクライオバーの上に置き、セクションがフリーズできるようにします。
以前に実証したように厚さ10マイクロメートルの組織切片を組織最適化または遺伝子発現スライドに切断する。ドライアイスの上に置いたスライドメーラーにスライドを移します。この図は、記載されたプロトコルを使用して培養された単離されたECを描写し、最小限の汚染細胞を有する明確な石畳のような形態を示す。
ECマーカー血管内皮カドヘリンの発現は、細胞間接合部を可視化する免疫蛍光を用いて確認した。細胞の約80%がCD31陽性であり、ヒト腸間膜動脈ECが新たに単離された細胞集団の大部分を占めていたことを示している。単離に失敗すると、形態が乱れた細胞が、間葉系マーカーを発現したり、線維芽細胞状態に似せて伸長したりする可能性がある。
図は、単離されたヒト腸間膜動脈ECS上での単一細胞RNAシーケンシングのための本プロトコールを用いて腸間膜動脈について単離された代表的な均一多様体近似および投影を示しており、34%の細胞はマーカーとしてPECAM1およびVWFを使用してECとしてクラスター化されている。高品質のRNAは、6以上のRNA完全性数を示すべきであり、28S対18SリボソームRNAバンドの比率は、可能な限り2に近い。これらのリボソームRNAシグナルの弱いまたは不在は、RNAが分解されるときに観察され得る。
ヘマトキシリンおよびエオジン染色は、血管の形態を視覚化し、関心領域を同定することを可能にした。遺伝子発現を、ヘマトキシリンおよびエオジン染色された血管上の空間アンカーで可視化した。組織および細胞ストックを慎重に取り扱い、特に空間トランスクリプトームプロファイリングにおいて、RNAの品質を維持します。
RNA の分解を減らすために、組織をドライアイスの上に置きます。また、切片と組織を予め冷却された器具で処理する。我々は、糖尿病との関連におけるLncRNAsおよび他の細胞型との相互作用を含むEC遺伝子発現変化を探索することができた。
我々は、空間トランスクリプトームプロファイリング技術を用いて、これらのトランスクリプトーム変化の位置を推測することができる。
