Caracterizar a expressão genética no nível transcriptômico é fundamental para entender a função celular na saúde e na doença. Nosso método se concentra na captura de células endoteliais, a camada crucial da parede vascular, das artérias menestéricas dos doadores humanos para perfil transcrito com uma resolução unicelular e espacial. Há uma população enriquecida de células endoteliais de um vaso sem um passo de classificação, o que pode causar perda celular.
Além disso, existem outros tipos de células que permitem a investigação de interações célula-células no contexto tecidual. Usamos essa técnica para investigar as alterações arteriais no diabetes e na obesidade. Dependendo da disponibilidade do vaso, essas técnicas também podem ser reaproveitadas para explorar a biologia em outras vasculaturas e outras doenças.
Se for a primeira vez, dois passos-chave requerem mais prática. Um, raspando, embora a força adequada deve ser exercida para remover células integrais sem separar camadas mais profundas. E dois, seção criostat.
Certifique-se de que as seções são frias, planas e estão dentro dos limites do slide especializado. Demonstrando o procedimento estarão Yingjun Luo e Xiaofang Tang, dois pesquisadores de pós-doutorado do meu laboratório. Para começar a lavar o tecido com DPBS.
Com fórceps estéreis e tesouras de dissecção, remova a gordura e os tecidos conjuntivos externos até que o vaso esteja limpo. Meça o comprimento do vaso com uma régua colocada fora do prato e leve registros fotográficos. Corte a artéria mesentérica longitudinalmente com uma tesoura para abrir o lúmen do vaso verticalmente.
Usando agulhas, conecte o recipiente à cera preta nos quatro cantos, expondo a intima. Adicione um mililitro de tampão de digestão pré-aquecido à intima. Usando um bisturi estéril, raspe suavemente o lúmen do vaso duas vezes.
Transfira o tampão de digestão para um tubo. Adicione um mililitro de tampão de digestão à intima e pipeta para cima e para baixo cuidadosamente para coletar as células restantes e transferir a suspensão celular para um tubo. Incubar células a 37 graus Celsius por cinco minutos em uma incubadora ou em um roqueiro.
Adicione m199 médio à suspensão celular para saciar a reação enzimática e misturar suavemente. Centrifugar a suspensão por cinco minutos a quatro graus Celsius e 600 vezes G.At o fim da centrifugação, remova e armazene o sobrenatante separadamente como uma cultura de controle para observar se todas as células são capturadas na pelota. Em seguida, suspenda novamente a pelota de célula em um mililitro do meio M199.
Avalie a viabilidade celular misturando 10 microliters de azul tripano com 10 microliters de estoque celular. Observe a morfologia celular e conte as células usando um hemótmetro. Cubra dois poços de uma placa de seis poços, canalhaste 500 microliters de reagente de fixação em poços por 30 minutos à temperatura ambiente.
Depois de lavar os poços com DPBS estéreis, dispense o estoque completo da célula em um poço, e o supernante é mantido como um controle para o segundo poço. Centrífuga previamente preparada estoque celular a quatro graus Celsius e 600 vezes G por cinco minutos. Remova o supernatante e suspenda a pelota suavemente com uma pipeta P-1000 em 0,04% BSA em DPBS.
Misture bem para garantir uma suspensão de célula única. Passe a solução através de um filtro de 40 micrômetros para remover detritos celulares. Em seguida, centrifufique a suspensão e remova o sobrenante como demonstrado.
Suspenda a pelota em 500 microlitres de 0,04% BSA em DPBS usando uma pipeta P-1000 e misture bem para garantir uma suspensão unicelular. Como demonstrado anteriormente, avalie a viabilidade celular usando o azul trypan. Usando um hemótmetro ou contador de células automatizada, observe a morfologia de suspensão de células únicas, verifique se há detritos teciduais e calcule o número de células vivas e mortas.
Depois de adicionar isopentane a um recipiente de metal, esfrie em nitrogênio líquido ou gelo seco. Despeje o composto OCT em poços de mofo crio de plástico rotulado, impedindo a formação de bolhas. Deixe o mofo criogeno no gelo seco para esfriar.
Corte pelo menos duas seções coronais de um centímetro no comprimento do vaso. Usando fórceps de 12 polegadas, submerse o tecido em isopentane até congelar. Submergir rapidamente o tecido em OUTUBRO na orientação com o lúmen visível no centro.
Segure e coloque os moldes criofos em gelo seco e observe o congelamento. O OCT ficará branco progressivamente do lado de fora em um ou dois minutos. Armazene essas seções em um recipiente seguro a menos 80 graus Celsius por até seis meses.
Configure a temperatura do criostat desejado para a cabeça da câmara e do espécime. Equilibre seções de vasos, facas, pincéis e slides em baixo de 20 graus Celsius no criostat por aproximadamente 30 minutos. Durante o equilíbrio, limpe a máquina e todos os equipamentos que possam tocar as seções, incluindo a lâmina, com 70% de etanol seguido da solução de descontaminação RNase.
Conecte a amostra distribuindo uma pequena quantidade de OCT no bloco criostat circular e colocando a amostra em cima antes de congelar. Depois de colocar o bloco no centro da cabeça da amostra, dane-se o bloco no lugar usando a alça preta alta à esquerda. Corte qualquer excesso de OCT em torno da nave.
Fixando a espessura de corte em 10 micrômetros no criostat, corte aproximadamente 60 seções e coloque-as em um tubo pré-resfriado de 1,5 mililitro contendo reagente de extração de RNA. Vórtice até que as seções sejam completamente dissolvidas. Extrair o RNA como descrito no manuscrito do texto e dissolver a pelota de RNA purificada em cinco microliters de água livre de RNase.
Corte seções de 10 micrômetros de espessura com placa anti-rolo no lugar. Vire e achate cuidadosamente tocando suavemente a seção através do OCT circundante Limpe o slide com etanol e pré-aqueça a parte traseira da área de captura com o dedo.
Usando escovas criostat sem RNase ou o slide diretamente, coloque a seção de tecido dentro do quadrado usando apenas o OCT circundante. Coloque imediatamente um dedo na parte de trás da área de captura para derreter a seção no slide. Uma vez que a seção adere, coloque o slide na barra criogenia para permitir que a seção congele.
Corte seções de tecido de 10 micrômetros de espessura, como demonstrado anteriormente na otimização de tecido ou slides de expressão genética. Transfira o slide para um e-mail de slides colocado em gelo seco. A figura retrata CEs isolados cultivados usando o protocolo descrito exibindo uma morfologia distinta como paralelepípedo com células contaminantes mínimas.
A expressão da cadherina vascular do marcador EC foi confirmada usando imunofluorescência visualizando junções célula-célula. Aproximadamente 80% das células eram CD31-positivas, indicando que as CEs arterials mesentéricas humanas compõem a maior parte da população celular recém-isolada. Isolamentos mal sucedidos resultam em células com morfologia perturbada, potencialmente expressando marcadores mesenquimais ou alongando-se a um estado fibroblástico.
A figura mostra uma aproximação e projeção uniforme representativa isolada para artéria mesentérica usando o protocolo atual para sequenciamento de RNA unicelular em ECS arterial mesentérica humana isolada, com células 34% agrupadas como CEs usando PECAM1 e VWF como marcadores. O RNA de alta qualidade deve mostrar um número de integridade de RNA não inferior a seis, e a razão de bandas de RNA ribossômicos de 28S a 18S é o mais próximo possível de duas bandas de RNA ribossômicos. Uma fraca ou ausência desses sinais ribossômicos de RNA pode ser observada quando as RNAs são degradadas.
A hematoxilina e a coloração de eosina visualizaram a morfologia do vaso, permitindo identificar regiões de interesse. A expressão genética foi visualizada com ancoragem espacial no vaso manchado de hematoxilina e eosina. Manuseie o estoque de tecidos e células cuidadosamente para manter a qualidade do RNA, especialmente para o perfil de transcriptome espacial.
Certifique-se de que o tecido é colocado em gelo seco para reduzir a degradação do RNA. Além disso, manuseie as seções e o tecido com instrumentos pré-resfriados. Conseguimos explorar as mudanças na expressão genética da CE, incluindo LncRNAs no contexto do diabetes e sua interação com outros tipos de células.
Podemos deduzir a localização dessas alterações transcriômicas usando técnicas de perfil de transcriptome espacial.
