אפיון ביטוי גנים ברמת השעתוק הוא המפתח להבנת תפקוד התאים בבריאות ובמחלות. השיטה שלנו מתמקדת בלכידת תאי אנדותל, השכבה החיונית של דופן כלי הדם, מהעורקים המנסטריים של התורמים האנושיים לצורך פרופיל תעתיק עם רזולוציה חד-תאית ומרחבית. ישנה אוכלוסייה מועשרת של תאי אנדותל מכלי ללא שלב מיון, מה שעלול לגרום לאובדן תאים.
יתר על כן, קיימים סוגי תאים אחרים המאפשרים לחקור אינטראקציות בין תאים לתאים בהקשר הרקמה. השתמשנו בטכניקה זו כדי לחקור את השינויים העורקיים בסוכרת ובהשמנת יתר. בהתאם לזמינות של כלי השיט, ניתן גם לייעד מחדש טכניקות אלה כדי לחקור ביולוגיה בכלי דם אחרים ובמחלות אחרות.
אם זו הפעם הראשונה, שני שלבים מרכזיים דורשים את התרגול הרב ביותר. האחת, יש להפעיל כוח מגרד, אם כי הולם, כדי להסיר תאים אינטגרליים מבלי לנתק שכבות עמוקות יותר. ושתיים, חתך קריוסטאט.
ודא שהמקטעים קרים, שטוחים ונמצאים בגבולות השקופית המיוחדת. מי שידגימו את ההליך יהיו יינג'ון לואו ושיאופנג טאנג, שני חוקרי פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל לשטוף את הרקמה עם DPBS.
עם מלקחיים סטריליים ומספריים דיסקציה, להסיר את השומן ואת רקמות החיבור החיצוניות עד הכלי נקי. מודדים את אורך הכלי עם סרגל המונח מחוץ לצלחת ומצלמים תיעוד צילומי. חותכים את העורק המזנטרי לאורך עם מספריים כדי לפתוח את לומן הכלי בצורה אנכית.
באמצעות מחטים, חברו את הכלי לשעווה שחורה בכל ארבע הפינות, וחשפו את האינטימה. הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ עיכול שחומם מראש לאינטימה. באמצעות אזמל סטרילי, לגרד בעדינות את לומן של הכלי פעמיים.
להעביר את חיץ העיכול לתוך צינור. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ עיכול לאינטימה ופיפטה למעלה ולמטה בזהירות כדי לאסוף את התאים הנותרים ולהעביר את תרחיף התא לצינור. דגירה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות באינקובטור או על נדנדה.
הוסיפו את מדיום M199 למתלה התא כדי להרוות את התגובה האנזימטית וערבבו בעדינות. צנטריפוגה של ההשעיה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ופי 600 G.At בסוף הצנטריפוגה, הסר ואחסן את הסופרנאטנט בנפרד כתרבית בקרה כדי לבחון אם כל התאים נלכדים בכדור. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום M199.
הערך את הכדאיות של התא על-ידי ערבוב של 10 מיקרוליטרים של כחול טריפאן עם 10 מיקרוליטרים של מלאי תאים. שימו לב למורפולוגיה של התאים וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. מצפים שתי בארות של צלחת בעלת שש בארות על ידי צנרת 500 מיקרוליטרים של ריאגנטים מחוברים לבארות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר שטיפת הבארות עם DPBS סטרילי, מחלקים את מלאי התאים המלא לבאר אחת, והסופרנטנט נשמר כבקרה לתוך הבאר השנייה. צנטריפוגה הכינה בעבר מלאי תאים בארבע מעלות צלזיוס ו-600 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את ה-supernatant והשעה מחדש את הכדור בעדינות עם פיפטה P-1000 ב-0.04% BSA ב-DPBS.
ערבבו היטב כדי להבטיח השעיה חד-תאית. מעבירים את התמיסה דרך מסננת של 40 מיקרומטר כדי להסיר את פסולת התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את המתלים והסירו את ה-supernatant כפי שהודגם.
השעו מחדש את הכדור ב-500 מיקרוליטרים של 0.04% BSA ב-DPBS באמצעות פיפטה P-1000 וערבבו היטב כדי להבטיח תרחיף חד-תאי. כפי שהוכח בעבר, העריכו את כדאיות התא באמצעות טריפאן כחול. באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי, שימו לב למורפולוגיית ההשעיה של התא הבודד, בדקו אם יש פסולת רקמות וחשבו את מספר התאים החיים והמתים.
לאחר הוספת איזופנטן למכל מתכת, יש להצטנן בחנקן נוזלי או בקרח יבש. יוצקים תרכובת OCT בבארות של עובש קריו מפלסטיק מסומן, ומונעים היווצרות בועות. השאירו עובש קריו על קרח יבש כדי לצנן.
חותכים לפחות שני חלקים קורונליים באורך של סנטימטר אחד באורך הכלי. באמצעות מלקחיים בקוטר 12 אינץ', מטביעים את הרקמה באיזופנטן עד להקפאה. הטביע במהירות את הרקמה ב- OCT בכיוון עם הלומן הנראה במרכז.
תפסו והניחו את תבניות הקריו על קרח יבש והתבוננו בקיפאון. ה-OCT יהפוך ללבן בהדרגה מבחוץ תוך דקה עד שתי דקות. אחסן חלקים אלה במיכל מאובטח במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.
הגדר את טמפרטורת הקריוסטט הרצויה עבור החדר וראש הדגימה. שיווי משקל קטעי כלי שיט משובצים OCT, סכינים, מברשות, ומחליקים למינוס 20 מעלות צלזיוס בקריוסטאט למשך כ-30 דקות. תוך כדי שיווי משקל, נקו את המכונה ואת כל הציוד שעשוי לגעת בחלקים, כולל הלהב, עם 70% אתנול ואחריו תמיסת טיהור RNase.
חברו את הדגימה על ידי חלוקת כמות קטנה של OCT על בלוק ה-cryostat העגול והנחת הדגימה למעלה לפני שהיא קופאת. לאחר הצבת הבלוק במרכז ראש הדגימה, הברג את הבלוק במקומו באמצעות הידית השחורה הגבוהה משמאל. חתכו כל עודף OCT המקיף את כלי השיט.
הגדרת עובי החיתוך ל-10 מיקרומטרים על הקריוסטט, חתכו כ-60 חלקים והניחו אותם בצינור 1.5 מיליליטר מקורר מראש המכיל ריאגנט מיצוי RNA. מערבולת עד שהקטעים מתמוססים לחלוטין. חלצו את הרנ"א כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט והמיסו את כדור הרנ"א המטוהר בחמישה מיקרוליטרים של מים נטולי RNase.
חותכים מקטעים בעובי 10 מיקרומטר עם צלחת נגד גלגול במקום. הפוך ושטח בזהירות על ידי נגיעה עדינה בקטע דרך ה- OCT שמסביב. נגב את המגלשה עם אתנול וחמם מראש את החלק האחורי של אזור הלכידה עם האצבע.
באמצעות מברשות cryostat ללא RNase או השקופית ישירות, מקם את קטע הרקמה בתוך הריבוע באמצעות OCT שמסביב בלבד. יש להניח מיד אצבע אחת על החלק האחורי של אזור הלכידה כדי להמיס את החלק אל המגלשה. לאחר שהמקטע נדבק, הניחו את השקופית על פס ה-cryo כדי לאפשר למקטע להקפיא.
חתכו מקטעי רקמה בעובי 10 מיקרומטר, כפי שהוכח קודם לכן באופטימיזציה של רקמות או בשקופיות ביטוי גנים. העבר את המגלשה לדואר שקופיות המונח על קרח יבש. האיור מתאר ECs מבודדים שעברו תרבית באמצעות הפרוטוקול המתואר המציג מורפולוגיה ייחודית דמוית אבן מרוצפת עם תאים מזהמים מינימליים.
ביטוי של סמן EC של קדהרין אנדותל וסקולרי אושר באמצעות אימונופלואורסצנציה המדמיינת צמתים בין תאים לתא. כ-80% מהתאים היו חיוביים ל-CD31, מה שמצביע על כך ש-ECs עורקיים מזנטריים אנושיים היוו את רוב אוכלוסיית התאים שבודדו זה עתה. בידודים לא מוצלחים גורמים לתאים עם מורפולוגיה מופרעת, שעלולים לבטא סמנים מזנכימליים או להתארך הדומים למצב פיברובלסטי.
האיור מראה קירוב סעפת אחיד מייצג והקרנה מבודדים עבור עורקים מזנטריים תוך שימוש בפרוטוקול הנוכחי לריצוף RNA חד-תאי על ECS עורקי מזנטריים אנושיים מבודדים, כאשר 34% מהתאים מקובצים כ-ECs באמצעות PECAM1 ו-VWF כסמנים. RNA באיכות גבוהה אמור להראות מספר שלמות RNA לא פחות משישה, והיחס בין 28S ל-18S רצועות RNA ריבוזומליות הוא קרוב ככל האפשר לשניים. ניתן להבחין בחלשה או בהיעדר אותות RNA ריבוזומליים אלה כאשר הרנ"א מתפרקים.
ההמטוקסילין והכתם של אאוסין דמיינו את המורפולוגיה של הכלי, ואפשרו לזהות אזורים מעניינים. ביטוי גנים הודגם באמצעות עיגון מרחבי על הכלי המוכתם בהמטוקסילין ובאוסין. טפלו בזהירות במלאי הרקמות והתאים כדי לשמור על איכות הרנ"א, במיוחד ליצירת פרופילי תעתיק מרחביים.
ודא שהרקמה מונחת על קרח יבש כדי להפחית את פירוק הרנ"א. כמו כן, טפלו בקטעים וברקמות באמצעות מכשירים מקוררים מראש. הצלחנו לחקור שינויים בביטוי גנים של EC, כולל LncRNAs בהקשר של סוכרת והאינטראקציה שלהם עם סוגי תאים אחרים.
אנו יכולים להסיק את מיקומם של שינויים תעתיקיים אלה באמצעות טכניקות של פרופיל תעתיק מרחבי.
