전사체 수준에서 유전자 발현을 특성화하는 것은 건강과 질병에서 세포 기능을 이해하는 열쇠입니다. 우리의 방법은 단일 세포 및 공간 분해능을 가진 전사 프로파일 링을 위해 인간 기증자의 메네스터 동맥에서 혈관 벽의 중요한 층 인 내피 세포를 포착하는 데 중점을 둡니다. 분류 단계없이 혈관에서 내피 세포의 농축 된 집단이 있으며, 이는 세포 손실을 일으킬 수 있습니다.
또한, 조직 맥락에서 세포-세포 상호작용의 조사를 허용하는 다른 세포 유형이 존재한다. 우리는이 기술을 사용하여 당뇨병과 비만의 동맥 변화를 조사했습니다. 혈관의 가용성에 따라, 이러한 기술은 또한 다른 혈관 구조 및 다른 질병에서 생물학을 탐구하기 위해 용도 변경 될 수 있습니다.
처음 사용하는 경우 두 가지 주요 단계가 가장 많은 연습이 필요합니다. 첫째, 긁어 모으는 것은 더 깊은 층을 분리하지 않고 적분 세포를 제거하기 위해 적절한 힘을 발휘해야하지만. 그리고 둘, 냉동 절개.
섹션이 차갑고 평평하며 특수 슬라이드의 경계 내에 있는지 확인합니다. 이 절차를 시연하는 것은 Yingjun Luo와 Xiaofang Tang, 내 실험실의 두 박사 후 연구원이 될 것입니다. DPBS로 조직을 세척하기 시작한다.
멸균 포셉과 해부 가위로 혈관이 깨끗해질 때까지 지방과 외부 결합 조직을 제거하십시오. 접시 외부에 놓인 통치자로 선박의 길이를 측정하고 사진 기록을 작성하십시오. 장간막 동맥을 가위로 길게 잘라 혈관 내강을 수직으로 엽니 다.
바늘을 사용하여 네 모서리의 검은 왁스에 용기를 부착하여 내막을 노출시킵니다. 내막에 미리 예열 된 소화 완충액 한 밀리리터를 넣으십시오. 멸균 메스를 사용하여 용기의 내강을 부드럽게 두 번 긁어냅니다.
소화 완충액을 튜브로 옮깁니다. 한 밀리리터의 소화 완충액을 인티마에 넣고 피펫을 조심스럽게 위아래로 올려 나머지 세포를 모으고 세포 현탁액을 튜브로 옮깁니다. 세포를 섭씨 37도에서 인큐베이터 또는 로커에서 5 분 동안 배양하십시오.
세포 현탁액에 M199 배지를 첨가하여 효소 반응을 켄칭하고 부드럽게 혼합한다. 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하고 원심분리 종료 G.At 600회 동안 원심분리하고, 대조군 배양물로서 상층액을 별도로 제거 및 보관하여 모든 세포가 펠렛에 포획되어 있는지 관찰한다. 이어서, 세포 펠릿을 1밀리리터의 M199 배지에 재현탁시킨다.
10 마이크로리터의 트리판 블루와 10 마이크로리터의 세포 스톡을 혼합하여 세포 생존율을 평가한다. 세포 형태를 관찰하고 혈구분석기를 사용하여 세포를 계수하십시오. 6웰 플레이트의 두 웰을 500마이크로리터의 부착 시약을 실온에서 30분 동안 웰에 피펫팅하여 코팅한다.
멸균 DPBS로 웰을 세척한 후, 전체 세포 스톡을 하나의 웰에 분배하고, 상청액을 대조군으로서 두 번째 웰로 유지한다. 원심 분리기는 이전에 섭씨 4도에서 세포 스톡을 준비했으며 5 분 동안 600 배 G에서 준비했습니다. 상청액을 제거하고 DPBS의 0.04%BSA에 P-1000 피펫으로 펠렛을 부드럽게 재현탁한다.
단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 잘 혼합하십시오. 용액을 40마이크로미터 스트레이너를 통해 통과시켜 세포 파편을 제거합니다. 이어서, 현탁액을 원심분리하고, 입증된 바와 같이 상청액을 제거한다.
펠렛을 P-1000 피펫을 사용하여 DPBS의 0.04%BSA 500 마이크로리터에 재현탁하고 잘 혼합하여 단일 세포 현탁액을 보장한다. 이전에 입증된 바와 같이, 트리판 블루를 사용하여 세포 생존율을 평가한다. 혈구계 또는 자동화 된 세포 카운터를 사용하여 단일 세포 현탁액 형태를 관찰하고 조직 파편을 확인하고 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 계산하십시오.
금속 용기에 이소펜탄을 첨가 한 후 액체 질소 또는 드라이 아이스에서 식히십시오. OCT 화합물을 라벨이 붙은 플라스틱 냉동 금형의 웰에 부어 거품 형성을 방지합니다. 냉동실 곰팡이를 드라이 아이스에 두어 차가워지게하십시오.
혈관 길이에서 한 센티미터의 적어도 두 개의 코로나 섹션을 자릅니다. 12인치 포셉을 사용하여 동결될 때까지 조직을 이소펜탄에 담그십시오. 중앙에서 보이는 내강과 배향하여 OCT의 조직을 빠르게 잠수시킵니다.
드라이 아이스 위에 냉동 금형을 잡고 놓고 동결을 관찰하십시오. OCT는 일에서 두 분 안에 외부에서 점진적으로 흰색이 될 것입니다. 이 섹션은 최대 6 개월 동안 영하 80도의 안전한 용기에 보관하십시오.
챔버 및 시편 헤드에 대해 원하는 냉동 온도 설정을 설정합니다. OCT 임베디드 용기 섹션, 나이프, 브러시 및 슬라이드를 냉동 상태에서 영하 20도까지 약 30 분 동안 평형화하십시오. 평형을 유지하면서 기계와 블레이드를 포함한 섹션에 닿을 수있는 모든 장비를 70 % 에탄올로 청소하고 RNase 오염 제거 용액을 사용하십시오.
소량의 OCT를 원형 냉동 장치 블록에 분배하고 샘플이 얼기 전에 위에 올려 놓음으로써 샘플을 부착하십시오. 블록을 시편 헤드의 중앙에 놓은 후 왼쪽의 키가 큰 검은 색 손잡이를 사용하여 블록을 제자리에 조이십시오. 선박을 둘러싼 과도한 OCT를 잘라냅니다.
냉동 스탯에서 절단 두께를 10 마이크로 미터로 설정하고 약 60 개의 섹션을 잘라 RNA 추출 시약이 들어있는 사전 냉각 된 1.5 밀리리터 튜브에 넣으십시오. 섹션이 완전히 용해 될 때까지 소용돌이. 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 RNA를 추출하고, 정제된 RNA 펠릿을 다섯 마이크로리터의 RNase-free 물에 용해시킨다.
안티 롤 플레이트를 제자리에 놓고 10 마이크로 미터 두께의 섹션을 자릅니다. 뒤집어서 주위의 OCT를 통해 섹션을 부드럽게 만져서 조심스럽게 평평하게 만듭니다. 에탄올로 슬라이드를 닦아내고 손가락으로 캡처 영역의 뒷면을 미리 따뜻하게 합니다.
RNase-free cryostat 브러시 또는 슬라이드를 직접 사용하여 조직 섹션을 주변 OCT만 사용하여 사각형 내에 놓습니다. 즉시 캡처 영역의 뒷면에 손가락 하나를 올려 놓으면 섹션이 슬라이드에 녹습니다. 섹션이 고정되면 슬라이드를 냉동 막대에 올려 놓으면 섹션이 고정되도록 합니다.
이전에 입증된 바와 같이 10마이크로미터 두께의 조직 절편을 조직 최적화 또는 유전자 발현 슬라이드로 절단한다. 슬라이드를 드라이 아이스 위에 놓인 슬라이드 메일러로 옮깁니다. 도면은 최소한의 오염 세포로 뚜렷한 조약돌 유사 형태를 표시하는 기술된 프로토콜을 사용하여 배양된 분리된 EC를 묘사한다.
EC 마커인 혈관 내피 카데린의 발현은 면역형광 시각화를 이용하여 세포간 접합을 확인하였다. 세포의 약 80%가 CD31 양성이었으며, 이는 인간 장간막 동맥 EC가 새로 분리된 세포 집단의 대부분을 구성함을 나타낸다. 실패한 분리는 형태학을 교란한 세포를 초래하여 잠재적으로 중간엽 마커를 발현하거나 섬유아세포 상태와 유사한 연장을 일으킨다.
도면은 분리된 인간 장간막 동맥 ECS에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 본 프로토콜을 사용하여 장간막 동맥에 대해 분리된 대표적인 균일한 매니폴드 근사 및 프로젝션을 보여주며, 34% 세포는 PECAM1 및 VWF를 마커로 사용하여 EC로 클러스터링된다. 고품질의 RNA는 6개 이상의 RNA 무결성을 나타내야 하며, 28S 대 18S 리보솜 RNA 밴드의 비율은 가능한 한 두 개에 가깝다. 이러한 리보솜 RNA 신호의 약하거나 부재는 RNA가 분해될 때 관찰될 수 있다.
헤마톡실린 및 에오신 염색은 혈관의 형태를 가시화하여, 관심 영역을 식별할 수 있게 하였다. 유전자 발현은 헤마톡실린- 및 에오신-염색된 혈관 상의 공간적 앵커링으로 가시화되었다. 특히 공간 전사체 프로파일링을 위해 RNA 품질을 유지하기 위해 조직 및 세포 스톡을 신중하게 처리합니다.
RNA 분해를 줄이기 위해 조직이 드라이 아이스 위에 놓여 있는지 확인하십시오. 또한 사전 냉각 된 장비로 절편과 조직을 다루십시오. 우리는 당뇨병과 관련된 LncRNAs와 다른 세포 유형과의 상호 작용을 포함하여 EC 유전자 발현 변화를 탐구 할 수있었습니다.
우리는 공간 전사체 프로파일 링 기술을 사용하여 이러한 전사체 변화의 위치를 추론 할 수 있습니다.
