ヘモグロビンの脳室内注射による新生児脳室内出血のモデリング

このプロトコルは、IVH誘発性脳損傷と水頭症の臨床的に関連するモデルを開発し、心室へのヘモグロビン注射を利用して、新しい治療戦略をテストするための心室容積のその後の定量を可能にするため、重要です。この技術の主な利点は、ヘモグロビンおよび鉄経路血液分解産物によって特異的に媒介されるIVHの病理学の研究を可能にすることである。この手法も使いやすく、用途が広いです。

この技術の意味は、IVHの病態生理学のさらなる理解と、IVH後の神経学的後遺症の予防のための臨床的に関連する治療戦略の評価を可能にするため、出血後水頭症の治療法の開発にまで及びます。手順を実演するのは、オーストラリア研究所のアソシエイトポスドクであるスルティラマギリです。まず、麻酔をかけたラットを定位装置に入れ、鼻を麻酔アダプターに配置します。

次に、外耳道の破裂していないイヤーバーを締めて頭を固定します。頭をきれいにするには、まず頭の中心にあるベタジンに浸した滅菌綿の先端のアプリケーターに触れ、外側に移動してベタジンを円を描くように広げます。次に、70%エタノールに浸したアプリケーターでこのプロセスを繰り返します。

次に、メスを使用して、頭の中央を垂直に0.3センチメートル切開して、頭蓋骨の頭蓋骨を露出させます。次に、綿の先端のアプリケーターを使用して領域を乾かします。定位インジェクターをセットアップするには、事前に調製したヘモグロビン溶液を0.3または0.5ミリリットルのシリンジに引き込み、シリンジを定位インジェクターシステムに入れます。

次に、定位インジェクターインターフェースをオンにし、構成ボタンをクリックして注入量とレート設定を入力します。音量をクリックし、音量を20, 000ナノリットルに設定します。次に、注入速度をクリックして、速度を毎分8, 000ナノリットルに設定します。

位置のリセットボタンをクリックして、構成を終了します。針先にヘモグロビンの小さなビーズが現れるまで注入ボタンをクリックして針先を洗い流し、次に綿の先端のアプリケーターを使用してビーズをそっと取り除きます。動物注射を開始するには、注射器の中外側および前後の位置を調整することにより、定位注射システムでブレグマをゼロに設定します。

次に、注射針を下げて、ブレグマの頭蓋骨にそっと触れます。選択した座標を特定したら、シリンジ針を頭蓋骨の1センチ上に上げて頭皮をクリアします。中外側座標と前後座標を設定します。

次に、針が頭蓋骨にそっと触れるように注射器を下げ、背腹座標を30秒以上設定します。座標を設定したら、定位インジェクタインターフェイスの実行ボタンをクリックして注入を開始します。注入が終了したら、溶液の逆流を最小限に抑えるために針を2分間そのままにします。

次に、針先が頭皮から2センチメートル上になるまで、2分間にわたって背腹座標に沿って注射器をゆっくりと引き出します。次に、定位インジェクターアームを手術野から離れて回転させ、6-Oモノフィラメント縫合糸で頭皮を閉じます。MRIの場合、T2強調高速スピンエコーシーケンスを選択してT2強調イメージングを実行します。

本文の説明に従ってMRIパラメータを設定した後、続行ボタンをクリックしてシーケンスを開始します。画像処理と脳容積分析のために、セグメンテーションソフトウェアでネイティブT2重み付けデータを開きます。側脳室を手動で描写するには、ペイントブラシモードをクリックして正方形のブラシスタイルを選択し、ブラシサイズを1に調整します。

次に、[レイアウトインスペクター]をクリックし、[軸方向ビュー]を選択して、[ズーム]をクリックして合わせます。次に、画像にカーソルを置き、側脳室空間をトレースして埋めます。最後に、ツールバーのセグメンテーションをクリックし、次にボリュームと統計をクリックしてセグメント化されたボリュームを表示します。

ヘモグロビン注射を受けた動物は、MRIで評価すると中等度の心室腫大を発症しました。ACSF注射動物と比較して、ヘモグロビン注射後24時間および72時間で有意に大きな側脳室を有する。2つのグループのラット間の側脳室容積の差は38日後に有意ではありませんでしたが、MRIスキャンは、ヘモグロビンを投与されたラットの44%がまだ未解決の心室腫大を有することを示しました。

また、ACSFと比較して、ヘモグロビンの注入は38日後に白質体積の有意な減少をもたらした。ヘモグロビンはまた、生理食塩水または全血ではなく、ヘモグロビンを注射した後の炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子αの有意に高いレベルから明らかなように、in vivoでの炎症反応を促進した。さらに、グリア線維性酸性タンパク質の免疫組織化学的染色により、ヘモグロビン注入後、ACSF注射後よりもアストロサイトの活性化が有意に高いことが明らかになりました。

この手順を試みるときに覚えておくべき最も重要なことは、側脳室へのヘモグロビン送達を確実にするために正しい注射座標を設定することです。この手順に従って、CSFトレーサーをCSF空間に送達して、CSF循環の変化、およびIVH後の排出パターンを評価することができます。この追加の方法は、IVH PHHでCSFフローがどのように変化するかに対処します。