このプロトコルは、癌関連線維芽細胞またはCAFの活性化における腫瘍微小環境の重要性を強調しています。表現型の特徴を研究するための優れたin vitroモデルである可能性があります。CAF生物学における主な制約は、原発腫瘍生検サンプルからのCAFの入手可能性が限られていることにあります。
したがって、この手法は、CAF生物学のさまざまな側面を研究するために使用できます。この研究は、腫瘍予後不良につながるCAF活性化に関連する異常な交差産生とミトコンドリア機能障害を示しています。この方法の適用は、腫瘍の外傷相互作用、特にCAF活性化とミトコンドリアの健康を評価するのに役立ちます。
新規創薬標的を探索するため。個人は、この技術を実行する前に細胞手順の経験を持っている必要があります。この技術の視覚的なデモンストレーションにより、腫瘍スフェロイドからCAF集団を分離する際の重要なステップと、CAF生物学を研究するためのダウンストリームアプリケーションを理解することができます。
私の研究室の助手であるリーナ・アローラさん、モイナ・カリアさん、スミャジット・ロイさんが実験を行っています。ヒト肺腺癌A549およびヒト肺線維芽細胞MRC-5接着細胞をDMEMおよびヒト単球THP-1細胞をRPMI中で増殖させ始めるには、T25フラスコ中の完全増殖培地中、5%二酸化炭素を含む加湿チャンバー内で摂氏37度で増殖させる。
3日後、80〜85%の細胞コンフルエントで、A549およびMRC-5細胞を1ミリリットルのPBSで1分間洗浄します。次に、500マイクロリットルの0.25%トリプシンEDTA溶液で摂氏37度で5分間インキュベートして細胞を回収します。次に、直ちに4ミリリットルの完全増殖培地を加えてトリプシンを不活性化します。
細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに集め、125 x gで5分間ペレット化します。上清を除去し、細胞を5ミリリットルの完全増殖培地に再懸濁します。多細胞腫瘍スフェロイドを確立するには、1ミリリットルの容量のセルカウンターを使用してA549、MRC-5、およびTHP-1細胞数をカウントします。
カウント後、細胞懸濁液を5:4:1の比率で調製し、完全なDMEMで容量を1ミリリットルに構成します。次に、25マイクロリットルの細胞懸濁液を90ミリメートルの培養皿のカバーの上に置きます。皿の底に10ミリリットルの滅菌水を入れます。
水で満たされたハイドレーションチャンバーの蓋を慎重に反転させ、ディッシュを細胞培養インキュベーターに3日間置きます。4日目に、顕微鏡下でスフェロイドをモニターします。画像を取得するには、電源スイッチをオンにします。
90ミリの培養皿をステージに置き、倍率10倍を選択します。レンズを調整し、細胞を調べて細胞の凝集と増殖を分析します。提供されているフリーズボタンと保存ボタンを押して、画像をキャプチャします。
イメージング後、各液滴から20マイクロリットルの培地を新しい培地で注意深く吸引することにより、増殖培地を交換します。ライブデッドイメージングの場合は、Ctrアドバンスト(スイッチ1)をオンにしてからCPUをオンにして、ソフトウェアシステムが起動するのを待ちます。起動したら、スフェロイドを含む90ミリ皿を倒立蛍光顕微鏡のステージに置きます。
次に、ソフトウェアで蛍光オプションを選択し、カルセインとテキサスレッドチャンネルのFITCを選択して、10倍の倍率で画像を観察およびキャプチャします。次に、オプションを選択し、画像をライブで表示します。適切な最適化のために蛍光強度を調整し、安全なボタンをクリックします。
1ミリリットルのピペットと15ミリリットルのチューブを使用して、7日目と10日目にそれぞれ200個の腫瘍、スフェロイドを収集します。次に、125 x gで5分間遠心分離してスフェロイドをペレット化し、上清を注意深く吸引します。スフェロイドを200マイクロリットルのPBSで洗浄し、再度遠心分離して上清を廃棄します。
スフェロイド崩壊のために400マイクロリットルの0.25%トリプシンEDTA溶液を加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。スフェロイドを完全に崩壊させるために、激しいピペッティングを行います。1ミリリットルの完全DMEM増殖培地を加えてトリプシンを中和します。
次に、スフェロイド懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄してから、ペレットを1ミリリットルの完全DMEM培地に再懸濁します。示されているように、セルの総数を数えます。腫瘍スフェロイドからがん関連線維芽細胞またはCAFを単離するには、1 x 10を80マイクロリットルの冷磁気活性化細胞ソーティングまたはMACSバッファーで7番目の細胞に再懸濁します。
20マイクロリットルの抗線維芽細胞マイクロビーズを細胞懸濁液に加え、チューブを軽くたたいてよく混ぜ、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルの冷たいMACSバッファーで細胞を洗浄します。次に、ペレットを500マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁する前に、上清を遠心分離して吸引します。
磁気ビーズベースの細胞分離の場合は、3ミリリットルのMACSバッファーでリンスしてMACSカラムを調製します。細胞懸濁液をカラムに入れ、標識されていない細胞集団を含むフロースルーを回収します。次に、カラムを3ミリリットルのMACSバッファーで3回洗浄してから、セパレーターから取り出します。
次に、カラムを収集チューブに置きます。5ミリリットルのMACSバッファーを加え、プランジャーをカラムにしっかりと押し込むことにより、抗線維芽細胞マイクロビーズ標識細胞を回収します。標識した細胞を遠心分離してから、ダウンストリームアプリケーションに進みます。
単離されたCAFの数をカウントし、フローサイトメトリー分析のために約6 x 10から4番目の細胞を使用します。細胞をPBSで一度洗浄した後、遠心分離して上清を吸引します。次に、100マイクロリットルの細胞透過処理バッファーを加え、細胞を摂氏4度で30分間、断続的なボルテックスでインキュベートして、単一の細胞懸濁液を維持します。
再度、細胞を遠心分離し、透過処理バッファーに再懸濁した後、2マイクロリットルのAPC結合抗ヒトアルファSMA抗体を添加し、摂氏4度で45分間インキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルの透過処理バッファーと遠心分離機を加えて、余分な抗体を除去します。フローサイトメトリー用の400マイクロリットルの透過処理バッファーにペレットを再懸濁します。
前方散乱と側方散乱に基づいて細胞の集団を区別した後、ACTA2陽性細胞を選択します。一重項母集団を選択し、続いて単一パラメータヒストグラム上に単一のピークとして現れるACTA2陽性細胞を選択する。多細胞腫瘍スフェロイドの発達と生死解析を示します。
7日目には、スフェロイドは直径約260ミクロンのコンパクトで剛性がありました。10日目には、スフェロイドの直径は480ミクロンでした。細胞生存率アッセイでは、7日目から10日目にかけてヨウ化プロピジウム蛍光の減少およびカルセインAM蛍光の増加が観察された。
低酸素染色により、10日目のスフェロイドの中心に低酸素コアが明らかになりました。さらに、腫瘍スフェロイド形成日数の増加に伴うE-カドヘリンおよびMki-67遺伝子発現のアップレギュレーションが観察された。10日目の腫瘍スフェロイドから単離されたCAFは、約69%ACTA2陽性であった。
CAFは、MRC-5線維芽細胞と比較して、ACTA2で3倍、コラーゲン1型アルファ2鎖で10倍のアップレギュレーションを示しました。腫瘍スフェロイド10日目のROSレベルの有意な増加が7日目と比較して観察され、CAF活性化に対するROS生成の関与の可能性が示唆されました。腫瘍スフェロイドの7日目と10日目から単離されたCAFの細胞ROSレベルの有意な増加が観察されました。
また、JC-1染色によりミトコンドリア膜電位の変化が見られた。GLUT1およびMCT4遺伝子発現の誘導は、正常な線維芽細胞と比較してCAFで観察されました。乳酸デヒドロゲナーゼ、シトクロムCオキシダーゼおよびコハク酸デヒドロゲナーゼ酵素活性の有意な誘導は、正常な線維芽細胞と比較してCAFで観察された。
3D多細胞腫瘍スフェロイドの開発を成功させるには、A549、MRC-5、およびTHP-1細胞の比率を5:4:1で使用する必要があります。線維芽細胞集団は、腫瘍スフェロイドの剛性にとって重要である。陽イオン溶液および特性評価と同様に、この腫瘍スフェロイドを使用して、腫瘍進行の共犯者である腫瘍関連マクロファージ細胞集団を得ることもできる。
このスフェロイド解析は、線維芽細胞を交差させたがん細胞がCAFの活性化にどのように関与しているかを理解するのに役立ち、ミトコンドリア特異的な薬剤候補を確認するためにも使用できます。
