このプロトコルの全体的な目標は、赤色脂肪組織、乾燥間葉系幹細胞を単離および特徴付け、簡単な方法を使用してインスリン産生細胞に向けて分化させることである。間葉系幹細胞は、遺伝学の分野でその道を見いだしてきた。それらは、骨髄、脂肪組織および周産期組織などの様々な供給源から単離することができる。
彼らは優れた文化的特徴を受け入れます。それらは多能であり、潜在的に様々な疾患を治療することができる。脂肪組織は、間葉系幹細胞の豊富な供給源を提供する。
これらの脂肪MSCは、骨髄のような他の供給源と比較して高収率で容易に脂肪吸引液から単離することができる。そして、それらは自家移植と同種異系移植の両方に良い情報源を提供することができます。このビデオでは、ラット精巣上体脂肪からの脂肪間葉系幹細胞の単離および特性評価のための簡単なプロトコルを提示している。
この手順は、単離のための簡単で非常に効率的な方法です。単離後、我々はこれらの脂肪間葉系幹細胞からインスリン産生細胞への分化を、単純で比較的短いプロトコールを用いて耐える。精巣上体脂肪のコラーゲン消化による脂肪間葉系幹細胞の単離から始めて、より強い血管画分を得る。
その後、間葉系幹細胞は、その可塑性接着、ならびにCDマーカーの発現および複数の中胚葉系への分化によって特徴付けられるであろう。動物を麻酔し、子宮頸部脱臼を用いて安楽死させる。全身に70%エタノールをスプレーし、腹部下部の皮膚と筋肉の切除から始めます。
その後、精巣上体脂肪で精巣を露出させます。精巣上体脂肪を優しくカットする。脂肪で血管を切らないように注意してください。
バイオ安全キャビネットで、鉗子とメスを使用して脂肪組織を細かく切ります。脂肪組織を10ミリリットルの滅菌PBSを含む遠沈管に移す。ファルコンチューブを45秒間傾けて洗浄を開始します。
その後、チューブを5分間放置して2層に分離します。10ミリリットルのシリンジを使用して注入PBSを取り除きます。PBSが透明になるまで、この洗浄手順を4〜5回繰り返します。
洗浄後、脂肪組織をコラーゲン溶液に再懸濁し、次いで組織がほぼ均質になるまで振とう水浴中でインキュベートする。その後、コラーゲン状混合物を15秒間組織に渦巻き、その後5分間遠心分離した。遠心分離後、3つの層があります。
間質血管画分の上の上清を慎重に捨てる。最初に上部の油層を慎重に廃棄し、続いて間質血管画分ペレットを乱すことなくエコー層を廃棄する。間質血管画分を滅菌BSAに再懸濁し、5分間再遠心分離する。
全遠心分離を行い、完全なDMEM F-12培地を25センチメートル四方のフラスコに入れる。遠心分離後、上清を捨て、間質血管ペレットを完全なDMEM F-12培地に再懸濁する。培養フラスコに移す。
37度5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。翌日、付着していない細胞を取り除き、培地を新鮮な培地と交換する。単離の翌日から開始すると、線維芽細胞様細胞が出現し始める。
それから徐々に時間が経つにつれて、彼らは数とサイズが増加します。継代することにより、細胞はより均質になります。これらの細胞は、全ての間葉系幹細胞特徴付け基準を示す。
これらの細胞は、ニコチンアミドベータメルカプトエタノールおよびエキセンディン−4を含むこの単純なプロトコールを用いてインスリン産生細胞に向けて分化させた。分化の段階を通して、細胞は線維芽細胞の形を失い始め、クラスターのような形態だと思います。インスリン産生細胞を用いると、陽性の真紅赤色ジシトン染色を示し、次いで、使用インスリン産生細胞は、Pdx-1、mafAおよびインスリンのような様々なベータ細胞マーカーを発現する。
さらに、誘導されたインスリン産生細胞は、より高いグルコース濃度で挑戦されると、上清中のより高いレベルのインスリンを分泌する。我々は、脂肪間葉系幹細胞の単離および特性評価のための詳細で段階的なプロトコールを提供した。我々はまた、脂肪間葉系幹細胞をインスリン産生細胞に分化させるための比較的短く、単純かつ効率的なプロトコールをここで提供する。
これは、研究者が間葉系幹細胞の分野に参入し、インスリン産生細胞への分化を研究するためのゲートウェイを提供します。
