O objetivo geral deste protocolo é isolar e caracterizar tecido adiposo vermelho, células-tronco mesenquimais secas e diferenciá-las para células produtoras de insulina usando métodos simples. Células-tronco mesenquimais encontraram caminhos no campo da genética. Eles podem ser isolados de várias fontes, como medula óssea, tecido adiposo e tecido perinatal.
Eles aceitam excelentes características culturais. Eles são multipotentes e podem potencialmente tratar várias doenças. O tecido adiposo fornece uma rica fonte de células-tronco mesenquimais.
Estes MSCs adiposos podem ser isolados de lipo aspira facilmente com alto rendimento em comparação com outras fontes como medula óssea. E eles podem fornecer uma boa fonte para transplantes autólogos e aogênicos. Neste vídeo estão apresentando um protocolo simples para isolamento e caracterização de células-tronco mesenquimais adiposas de gordura epidídica de ratos.
Este procedimento é um método simples e altamente eficiente para o isolamento. Após o isolamento, suportaremos a diferenciação dessas células-tronco mesenquimais adiposas em células produtoras de insulina usando um protocolo simples e relativamente curto. Começaremos com o isolamento de células-tronco mesenquimais adiposas por digestão colágena de gordura epidídica para obter uma fração vascular mais forte.
Em seguida, as células-tronco mesenquimais serão caracterizadas por sua adesão plástica, bem como expressão de marcadores de CD e diferenciação em múltiplas linhagens mesodérmicas. Anestesiar o animal, depois eutanásia usando luxação cervical. Espirre todo o corpo com 70% de etanol e comece com excisão da pele e dos músculos na parte inferior do abdômen.
Em seguida, exponha os testículos com a gordura epidímica. Corte suavemente a gordura epidídica. Tenha cuidado para não cortar os vasos sanguíneos com as gorduras.
Em um armário de segurança biológica, corte o tecido adiposo em pequenos pedaços usando fórceps e bisturi. Transfira o tecido adiposo para tubo de centrífuga contendo 10 mililitros estéreis PBS. Comece a lavar inclinando o tubo falcão por 45 segundos.
Em seguida, mantenha o tubo em pé por cinco minutos para separar em duas camadas. Remova o PBS infraado usando uma seringa de 10 mililitros. Repita estas etapas de lavagem quatro a cinco vezes até que o PBS esteja limpo.
Após a lavagem, suspenda novamente o tecido adiposo em solução colágena e, em seguida, incubar no banho de água tremendo até que o tecido esteja quase homogêneo. Depois, o vórtice a mistura de tecido colágeno por 15 segundos, depois centrífuga depois por cinco minutos. Após a centrifugação, você terá três camadas.
Descarte cuidadosamente o sobrenante sobre a fração vascular estromica. Primeiro descarte a camada de óleo na parte superior cuidadosamente, seguido pela camada de ecos sem perturbar a pelota de fração vascular estromida. Suspenda a fração vascular stromal em BSA estéril e re-centrífuga por cinco minutos.
Centrifugação inteira, coloque mídia DMEM F-12 completa em frasco quadrado de 25 centímetros. Após a centrifugação, descarte o supernasciente e suspenda a pelota vascular estromica em toda a mídia DMEM F-12. E transferir para o frasco de cultura.
Coloque em incubadora de dióxido de carbono de 37 graus 5%. No dia seguinte, remova células nãoectadas e substitua a mídia por mídia fresca. A partir do próximo dia de isolamento, as células semelhantes ao fibroblasto começarão a aparecer.
Em seguida, gradualmente, com o passar do tempo, eles aumentarão em número e tamanho. Ao passar, as células se tornarão mais homogêneas. Essas células exibem todos os critérios de caracterização de células-tronco mesenquimais.
Estas células foram diferenciadas para células produtoras de insulina usando este protocolo simples contendo nicotinamida beta mercaptoetanol e Exendin-4. Ao longo dos passos de diferenciação, as células começam a perder sua forma fibroblástica e eu acho que aglomerado como morfologia. Quando as células produtoras de insulina usadas mostram uma coloração de dissimundo vermelha positiva, então as células produtoras de insulina expressam vários marcadores de células beta como Pdx-1, mafA e insulina.
Além disso, as células produtoras de insulina induzidas secretam níveis mais altos de insulina no supernante quando desafiados com maior concentração de glicose. Fornecemos um protocolo detalhado e passo a passo para o isolamento e caracterização das células-tronco mesenquimais adiposas. Também fornecemos aqui um protocolo relativamente curto, simples e eficiente para diferenciação de células-tronco mesenquimais adiposas em células produtoras de insulina.
Isso fornece uma porta de entrada para o pesquisador entrar no campo das células-tronco mesenquimais e estudar sua diferenciação em células produtoras de insulina.
