Bu protokolün genel amacı, kırmızı yağ dokusunu izole etmek ve karakterize etmek, mezenkimal kök hücreleri kurutmak ve basit yöntemler kullanarak insülin üreten hücrelere doğru ayırt etmektir. Mezenkimal kök hücreler genetik alanında yollar bulmuşlardır. Kemik iliği, yağ dokusu ve perinatal doku gibi çeşitli kaynaklardan izole edilebilirler.
Mükemmel kültürel özellikleri kabul ederler. Çok güçlüdürler ve potansiyel olarak çeşitli hastalıkları tedavi edebilirler. Yağ dokusu zengin bir mezenkimal kök hücre kaynağı sağlar.
Bu yağ MSC'leri, kemik iliği gibi diğer kaynaklara kıyasla yüksek verimle lipo aspiratlardan kolayca izole edilebilir. Ve hem otolog hem de allojenik transplantasyon için iyi bir kaynak sağlayabilirler. Bu videoda, sıçan epididim yağından yağ mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için basit bir protokol sunulmaktadır.
Bu prosedür, izolasyon için basit, son derece verimli bir yöntemdir. İzolasyondan sonra, bu yağ mezenkimal kök hücrelerinin basit, nispeten kısa bir protokol kullanarak insülin üreten hücrelere farklılaşmasına katlanacağız. Daha güçlü vasküler fraksiyon elde etmek için epididim yağının kollajenöz sindirimi ile yağ mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonu ile başlayacağız.
Daha sonra mezenkimal kök hücreler, plastik yapışmalarının yanı sıra CD belirteçlerinin ekspresyonu ve çoklu mezodermal soylara farklılaşma ile karakterize edilecektir. Hayvanı anestezi edin, daha sonra servikal çıkık kullanarak ötenazi yapın. Vücudun her yerine% 70 etanol püskürtün ve cildin ve karnın alt kısmındaki kasların eksizyonu ile başlayın.
Daha sonra testisleri epididim yağ ile açığa çıkarın. Epididim yağını nazikçe kesin. Kan damarlarını yağlarla kesmemeye dikkat edin.
Bir biyo güvenlik kabininde, forseps ve neşter kullanarak yağ dokusunu küçük parçalara ayırın. Yağ dokusunu 10 mililitre steril PBS içeren santrifüj tüpüne aktarın. Falcon tüpünü 45 saniye boyunca eğerek yıkamaya başlayın.
Ardından tüpü iki katmana ayırmak için beş dakika bekletin. İhlal edilmiş PBS'yi 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak çıkarın. PBS temizlenene kadar bu yıkama adımlarını dört ila beş kez tekrarlayın.
Yıkadıktan sonra, yağ dokusunu kollajenöz çözelti içinde tekrar askıya alın, daha sonra doku neredeyse homojen olana kadar çalkalayıcı su banyosunda inkübe edin. Daha sonra, doku kollajenöz karışımını 15 saniye boyunca vorteksleyin, daha sonra beş dakika boyunca santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra üç katmanınız olacak.
Süpernatantı stromal vasküler fraksiyonun üzerine dikkatlice atın. İlk önce üstteki yağ tabakasını dikkatlice atın, ardından stromal vasküler fraksiyon peletini rahatsız etmeden yankı tabakası izleyin. Stromal vasküler fraksiyonu steril BSA'da tekrar askıya alın ve beş dakika boyunca yeniden santrifüj yapın.
Tüm santrifüjleme, komple DMEM F-12 ortamını 25 santimetrekare şişeye yerleştirin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve stromal vasküler peleti tam DMEM F-12 ortamında tekrar askıya alın. Ve kültür şişesine transfer.
37 derece% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Ertesi gün, bağlanmamış hücreleri çıkarın ve ortamı taze ortamlarla değiştirin. İzolasyonun ertesi gününden itibaren, fibroblast benzeri hücreler ortaya çıkmaya başlayacaktır.
Sonra yavaş yavaş zaman geçtikçe sayı ve boyut olarak artacaklardır. Pasaj yaparak, hücreler daha homojen hale gelecektir. Bu hücreler tüm mezenkimal kök hücre karakterizasyon kriterlerini sergiler.
Bu hücreler, nikotinamid beta merkaptoetanol ve Exendin-4 içeren bu basit protokol kullanılarak insülin üreten hücrelere doğru farklılaştırıldı. Farklılaşma adımları boyunca hücreler fibroblastik şekillerini kaybetmeye başlar ve bence morfoloji gibi kümelenirler. Kullanılan insülin üreten hücreler pozitif kırmızı kırmızı disithon boyama gösterir, daha sonra kullanılan insülin üreten hücreler Pdx-1, mafA ve insülin gibi çeşitli beta hücre belirteçlerini eksprese eder.
Ek olarak, indüklenmiş insülin üreten hücreler, daha yüksek glikoz konsantrasyonu ile zorlandıklarında süpernatantta daha yüksek insülin seviyeleri salgılarlar. Yağ mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı, kademeli bir protokol sağladık. Ayrıca burada yağ mezenkimal kök hücrelerinin insülin üreten hücrelere farklılaşması için nispeten kısa, basit ve etkili bir protokol sunuyoruz.
Bu, araştırmacıların mezenkimal kök hücreler alanına girmeleri ve insülin üreten hücrelere farklılaşmalarını incelemeleri için bir geçit sağlar.
