Общей целью этого протокола является выделение и характеристика красной жировой ткани, высушенных мезенхимальных стволовых клеток и дифференцировка их в сторону инсулин-продуцирующих клеток с помощью простых методов. Мезенхимальные стволовые клетки нашли свои пути в области генетики. Они могут быть выделены из различных источников, таких как костный мозг, жировая ткань и перинатальная ткань.
Они принимают отличные культурные характеристики. Они являются многомощными и потенциально могут лечить различные заболевания. Жировая ткань обеспечивает богатый источник мезенхимальных стволовых клеток.
Эти жировые МСК могут быть легко выделены из липоаспиратов с высоким выходом по сравнению с другими источниками, такими как костный мозг. И они могут обеспечить хороший источник как для аутологичной, так и для аллогенной трансплантации. В этом видео представлен простой протокол выделения и характеристики жировых мезенхимальных стволовых клеток из жира придатка яичка крысы.
Эта процедура является простым высокоэффективным методом изоляции. После изоляции мы перенесем дифференцировку этих жировых мезенхимальных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие клетки с использованием простого, относительно короткого протокола. Начнем с выделения жировых мезенхимальных стволовых клеток путем коллагенового переваривания придатков яичка жира для получения более сильной сосудистой фракции.
Тогда мезенхимальные стволовые клетки будут характеризоваться их пластической адгезией, а также экспрессией CD-маркеров и дифференцировкой в несколько мезодермальных линий. Обезболивайте животное, затем усыпляете с помощью вывиха шейки матки. Распылите по всему телу 70% этанол и начните с иссечения кожи и мышц нижней части живота.
Затем обнажите яички с придатком яичка жира. Аккуратно срежьте придаточный жир. Будьте осторожны, чтобы не перерезать кровеносные сосуды с жирами.
В шкафу биологической безопасности разрежьте жировую ткань на мелкие кусочки с помощью щипцов и скальпеля. Переместите жировую ткань в центрифужную трубку, содержащую 10 миллилитров стерильного PBS. Начните стирку, наклонив трубку Falcon в течение 45 секунд.
Затем держите трубку в течение пяти минут, чтобы разделить ее на два слоя. Извлеките инфранированный PBS с помощью 10-миллилитрового шприца. Повторите эти шаги стирки четыре-пять раз, пока PBS не станет чистым.
После промывания повторно суспендировать жировую ткань в коллагеновом растворе, затем инкубировать на встряхивающей водяной бане до тех пор, пока ткань не станет почти однородной. После этого вихрьте тканевую коллагеновую смесь в течение 15 секунд, затем центрифугируйте в течение пяти минут. После центрифугирования у вас будет три слоя.
Осторожно отбросьте супернатант поверх стромальной сосудистой фракции. Сначала аккуратно отбросьте масляный слой сверху, затем слой эхо, не нарушая гранулу стромальной сосудистой фракции. Повторно суспендировать стромальную сосудистую фракцию в стерильном BSA и повторно центрифугировать в течение пяти минут.
Полную центрифугирование поместите полную среду DMEM F-12 в квадратную колбу площадью 25 сантиметров. После центрифугирования отбросьте супернатант и повторно суспендируйте стромальную сосудистую гранулу в полной среде DMEM F-12. И перенести на культурную колбу.
Поместите в 37 градусов 5% углекислого газа инкубатора. На следующий день удалите неприкрепленные ячейки и замените носитель свежим. Начиная со следующего дня изоляции, начнут появляться фибробластоподобные клетки.
Затем постепенно с течением времени они будут увеличиваться в количестве и размерах. При пассаже клетки станут более однородными. Эти клетки демонстрируют все критерии характеристики мезенхимальных стволовых клеток.
Эти клетки были дифференцированы в сторону инсулин-продуцирующих клеток с использованием этого простого протокола, содержащего никотинамид бета-меркаптоэтанол и эксендин-4. На протяжении этапов дифференцировки клетки начинают терять свою фибробластную форму, и я думаю, что кластерная морфология. При использовании инсулин-продуцирующих клеток наблюдается положительное окрашивание малиново-красного диситона, затем используемые инсулин-продуцирующие клетки экспрессируют различные бета-клеточные маркеры, такие как Pdx-1, mafA и инсулин.
Кроме того, индуцированные инсулин-продуцирующие клетки секретируют более высокие уровни инсулина в надосадочном веществе при вызове с более высокой концентрацией глюкозы. Мы предоставили подробный пошаговый протокол для выделения и характеристики жировых мезенхимальных стволовых клеток. Мы также приводим здесь относительно короткий, простой и эффективный протокол дифференцировки жировых мезенхимальных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие клетки.
Это обеспечивает возможность для исследователя войти в область мезенхимальных стволовых клеток и изучить их дифференцировку в инсулин-продуцирующие клетки.
