המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לבודד ולאפיין רקמת שומן אדומה, תאי גזע מזנכימליים מיובשים ולהבדיל אותם לעבר תאים המייצרים אינסולין בשיטות פשוטות. תאי גזע מזנכימליים מצאו את הדרכים בתחום הגנטיקה. ניתן לבודד אותם ממקורות שונים כגון מח עצם, רקמת שומן ורקמה פרינטלית.
הם מקבלים מאפיינים תרבותיים מצוינים. הם רב עוצמה ויכולים לטפל במחלות שונות. רקמת השומן מספקת מקור עשיר לתאי גזע מזנכימליים.
ניתן לבודד את השומן MSCs האלה מליפו-שואפים בקלות עם תפוקה גבוהה בהשוואה למקורות אחרים כמו מח עצם. והם יכולים לספק מקור טוב הן להשתלה אוטולוגית והן להשתלה אלוגנית. בסרטון זה מציגים פרוטוקול פשוט לבידוד ואפיון של תאי גזע מזנכימליים בשומן משומן אפידידימלי של חולדה.
הליך זה הוא שיטה פשוטה ויעילה ביותר לבידוד. לאחר הבידוד, נסבול את ההתמיינות של תאי גזע מזנכימליים אלה בשומן לתאים המייצרים אינסולין באמצעות פרוטוקול פשוט וקצר יחסית. נתחיל בבידוד של תאי גזע מזנכימליים בשומן על ידי עיכול קולגן של שומן אפידידימלי כדי להשיג שבר כלי דם חזק יותר.
לאחר מכן תאי גזע מזנכימליים יתאפיינו בהיצמדות הפלסטית שלהם, כמו גם בביטוי של סמני CD והתמיינות לשושלות מזודרמליות מרובות. להרדים את החיה, ולאחר מכן להרדים באמצעות פריקה צוואר הרחם. מרססים בכל הגוף עם 70% אתנול ומתחילים בכריתה של העור והשרירים בחלק התחתון של הבטן.
לאחר מכן חשוף את האשכים עם השומן האפידידימלי. חותכים בעדינות את השומן האפידידימלי. היזהרו לא לחתוך את כלי הדם עם השומנים.
בארון בטיחות ביולוגי, חותכים את רקמת השומן לחתיכות קטנות באמצעות מלקחיים ואזמל. העבר את רקמת השומן לצינור צנטריפוגה המכיל 10 מיליליטרים PBS סטריליים. התחילו לשטוף על ידי הטיית צינור הפלקון למשך 45 שניות.
לאחר מכן שמור את הצינור עומד במשך חמש דקות כדי להפריד לשתי שכבות. הסר את ה- PBS האינפראנאטי באמצעות מזרק 10 מיליליטר. חזור על שלבי שטיפה אלה ארבע עד חמש פעמים עד ש- PBS יהיה ברור.
לאחר שטיפה, להשעות מחדש את רקמת השומן בתמיסה קולגן, ולאחר מכן לדגירה באמבט מים רועדים עד שהרקמה כמעט הומוגנית. לאחר מכן, מערבלים את תערובת הקולגן של הרקמה במשך 15 שניות, ואז צנטריפוגה לאחר מכן במשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, יהיו לך שלוש שכבות.
יש להשליך בזהירות את ה-supernatant מעל שבר כלי הדם הסטרומי. תחילה השליכו את שכבת השמן בחלקה העליון בזהירות, ולאחר מכן את שכבת ההדים מבלי להפריע לכדור שבר כלי הדם הסטרומי. להשעות מחדש את שבר כלי הדם הסטרומיים ב- BSA סטרילי ולצנטריפוגה מחדש למשך חמש דקות.
צנטריפוגה שלמה, מקם את המדיה המלאה של DMEM F-12 בבקבוקון מרובע של 25 סנטימטרים. לאחר צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת כלי הדם הסטרומיים במדיית DMEM F-12 מלאה. ולהעביר לבקבוקון התרבות.
מקום בחממת פחמן דו חמצני 37 מעלות 5%. למחרת, הסר תאים לא מחוברים והחלף את המדיה במדיה טרייה. החל מיום הבידוד הבא, התאים דמויי הפיברובלסט יתחילו להופיע.
ואז בהדרגה ככל שיעבור הזמן הם יגדלו במספרם ובגודלם. על ידי מעבר, התאים יהפכו להומוגניים יותר. תאים אלה מציגים את כל הקריטריונים לאפיון תאי גזע מזנכימליים.
תאים אלה התמינו לעבר תאים המייצרים אינסולין באמצעות פרוטוקול פשוט זה המכיל ניקוטין-אמיד בטא מרקפטואתנול ואקסנדין-4. לאורך שלבי ההתמיינות, התאים מתחילים לאבד את הצורה הפיברובלסטית שלהם ולדעתי אשכול כמו מורפולוגיה. כאשר משתמשים בתאים המייצרים אינסולין, הם מראים צביעה חיובית של דיסיתון אדום ארגמן, ולאחר מכן משתמשים בתאים המייצרים אינסולין ומבטאים סמנים שונים של תאי בטא כמו Pdx-1, mafA ואינסולין.
בנוסף, תאים המושרים המייצרים אינסולין מפרישים רמות גבוהות יותר של אינסולין בסופרנטנט כאשר הם מאותגרים עם ריכוז גלוקוז גבוה יותר. סיפקנו פרוטוקול מפורט וצעדי לבידוד ואפיון של תאי גזע מזנכימליים בשומן. אנו גם מספקים כאן פרוטוקול קצר, פשוט ויעיל יחסית להתמיינות של תאי גזע מזנכימליים בשומן לתאים המייצרים אינסולין.
זה מספק שער לחוקר להיכנס לתחום תאי הגזע המזנכימליים ולחקור את התמיינותם לתאים המייצרים אינסולין.
