昆虫病原性真菌の単離は、バイオ農薬の開発にとって重要であり、この特定のグループの多様性、分布、および生態学を研究するのに役立ち得る。昆虫病原性真菌を単離するために昆虫餌を使用することは、低コストで非常に効率的な方法と考えられている。クロラムフェニコール、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、人工培地はドジンを使用せず、土壌サンプルプロセスでより少ないスペースを必要とします。
重要なステップには、1〜2週間後にCTCプレートを調査して、他の真菌が発達中の昆虫病原性真菌を狭小化させないようにすること、およびマクロ形態およびミクロ形態に基づいて昆虫病原性真菌コロニーを同定することが含まれる。小さなシャベルを使って800グラムの土を10センチメートルの深さまで集めることから始めます。実験開始まで室温でポリプロピレン袋にサンプルを保管する。
昆虫病原性真菌は根圏能力を有することが知られているので、小さな根も採取することができる。クロラムフェニコール、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、またはCTC選択的人工培地を用いた真菌の単離のために、根の有無にかかわらず土壌サンプルの重量0.35グラムを計量する。このサンプルを1.5ミリリットルのマイクロチューブに入れます。
バイオセーフティキャビネット内で作業しながら、1ミリリットルの滅菌0.01容量%ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート水性懸濁液を土壌を含むマイクロチューブに加え、チューブを30秒間渦巻きます。完了したら、上清の50マイクロリットルをCTC培地でペトリプレートの中央にピペットで取り除いた。次いで、直径6ミリメートルの滅菌ドリガルスキヘラを使用して、懸濁液を培地の表面に均質に分散させる。
プレートを気候室で摂氏25度、暗所で最低80%の相対湿度でインキュベートします。7日、14日、および21日間のインキュベーション後、真菌コロニーの成長のためのプレートを観察した。表面消毒したガレリア・メロネッラおよびテネブリオ・モリター後期幼虫を昆虫餌として用いて真菌を単離した。
幼虫を0.5%次亜塩素酸ナトリウムに1分間浸漬して滅菌する。その後、幼虫を滅菌水で2回洗浄する。集められた土250グラムを含む蓋に直径10ミリメートルの10個の小さな穴があるプラスチック製の鍋に餌を組み立てる。
1日おきに土壌を均質化して、幼虫と土壌との最大の接触を可能にし、毎日鉢を分析し、死んだ昆虫を探します。死んだ昆虫を鍋から取り除いた後、0.5%の次亜塩素酸ナトリウムで昆虫を1分間表面的に殺菌する。真菌症を優先するために、滅菌昆虫を相対湿度80%および摂氏25度の湿気の多い部屋に7日間置く。
真菌症では、昆虫表面から分生子を収穫し、微生物学的ループの助けを借りて、実体顕微鏡下で0.05%クロラムフェニコールまたはPDAC培地を含むジャガイモデキストロース寒天培地上に分生子を置く。別の方法として、感染した幼虫全体をPDAC培地上に置く。そして、先に説明したように培養プレートを気候チャンバー内でインキュベートする。
14日間のインキュベーション後、原稿に記載されているように、プレート上の真菌培養物のマクロ形態学的特徴を分析することによってEPF種を同定する。次に、空中分生子をスライド培養物に移し、相対湿度80%、摂氏25度で3日間培養します。3日後、スライドをラクトフェノールブルーで染色し、顕微鏡的特徴を観察した。
光学顕微鏡で、分生子の配置、分生子、形状、大きさなどの真菌構造を400倍で観察し、EPF同定を確認します。この研究では、メタリシウムおよびビーベリア種の51種のEPF株を524の土壌サンプルから単離した。代表的な分析は、メタリジウム種およびビーベリア種のいくつかの分離株の微形態学的特徴を示す。
24の土壌サンプルにおけるEPFの発生を、3つの異なる単離方法を用いて研究した。ガレリアメロネラ餌は単離においてより効率的であることが証明され、続いてテネブリオモリター餌およびCTC培地が続いた。同じ24の土壌サンプルはビーベリア種の回収を示さず、メタリシウムのみを示した。
覚えておくべき最も重要なことは、顕微鏡の特徴を観察し、形態学的キーを使用して昆虫病原性真菌の同定を確認するために、空中分生子をスライドコートに移すことです。追加の方法には、ドジンなどの汚染物質の増殖を減少させるための特定の化学物質を有する他の選択的人工媒体の使用が含まれる。優れたバイオ防除形質を有する新しい真菌分離株を探すことは、節足動物 - 害虫防除における真菌の有効性を高め、無脊椎動物の病理学分野におけるさらなる疑問を探求するために極めて重要である。
