تعد عزلة الفطريات المسببة للأمراض الحشرية مهمة لتطوير مبيد حيوي ويمكن أن تكون مفيدة لدراسة التنوع والتوزيع والبيئة لهذه المجموعة بالذات. يعتبر استخدام طعوم الحشرات لعزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية طريقة منخفضة التكلفة وعالية الكفاءة. الكلورامفينيكول ، الثيابيندازول ، السيكلوهيكسيميد ، الوسائط الاصطناعية لا تستخدم دودين وتتطلب مساحة أقل في عملية عينة التربة.
وتشمل الخطوات الحاسمة التحقيق في صفائح CTC بعد أسبوع وأسبوعين لمنع الفطريات الأخرى من التضييق والفطريات المسببة للأمراض الحشرية في التطور ، ثم تحديد مستعمرات الفطريات المسببة للأمراض الحشرية بناء على مورفولوجيتها الكلية ومورفولوجيا الجزئية. ابدأ بجمع 800 جرام من التربة على عمق 10 سم باستخدام مجرفة صغيرة. تخزين العينات في أكياس البولي بروبلين في درجة حرارة الغرفة حتى بداية التجربة.
يمكن أيضا جمع الجذور الصغيرة لأن الفطريات المسببة للأمراض الحشرية معروفة بكفاءة الريزوسفير. لعزل الفطريات باستخدام الكلورامفينيكول أو الثيابيندازول أو السيكلوهيكسيميد أو الوسط الاصطناعي الانتقائي CTC ، يزن 0.35 جرام من عينة التربة مع أو بدون جذور. ضع هذه العينة في أنبوب دقيق 1.5 ملليلتر.
أثناء العمل في خزانة السلامة الأحيائية، أضف ملليلتر واحد من التعليق المائي المعقم بنسبة 0.01 في المائة من البولي أوكسي إيثيلين سوربيتان أحادي الكوليت إلى الأنبوب الصغير الذي يحتوي على تربة ودوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية. عند الانتهاء من إزالة وماصة 50 ميكرولتر من supernatant على وسط لوحات بتري مع وسط CTC. ثم استخدم ملعقة Drigalski معقمة قطرها ستة ملليمترات لتفريق المعلقات بشكل متجانس على سطح الوسط.
احتضان الألواح في غرف المناخ عند 25 درجة مئوية ورطوبة نسبية لا تقل عن 80٪ في الظلام. بعد سبعة و 14 و 21 يوما من الحضانة ، راقب اللوحات لنمو المستعمرات الفطرية. لعزل الفطريات باستخدام سطح مطهر غاليريا ميلونيلا ويرقات تينبريو موليتور في مرحلة متأخرة كطعوم حشرات.
اغمر اليرقة في هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 0.5٪ لمدة دقيقة واحدة للتعقيم. ثم اغسل اليرقات مرتين بالماء المعقم. قم بتجميع الطعوم في أواني بلاستيكية بها 10 ثقوب صغيرة قطرها 10 ملليمترات في الغطاء تحتوي على 250 جراما من التربة المجمعة.
تجانس التربة كل يومين للسماح بأقصى قدر من الاتصال بين اليرقات وتحليل الأواني يوميا ، بحثا عن الحشرات الميتة. بعد إزالة الحشرات الميتة من الوعاء ، قم بتعقيم الحشرات بشكل سطحي بنسبة 0.5٪ من هيبوكلوريت الصوديوم لمدة دقيقة واحدة. لصالح الفطار ، ضع الحشرات المعقمة في غرفة رطبة عند رطوبة نسبية 80٪ و 25 درجة مئوية لمدة سبعة أيام.
على الفطار ، قم بحصاد الكونيديا من سطح الحشرات وبمساعدة الحلقة الميكروبيولوجية ، ضع الكونيديا على وسط أجار سكر العنب بالبطاطس الذي يحتوي على 0.05٪ كلورامفينيكول أو وسط PDAC تحت مجهر مجسم. كبديل ، ضع اليرقات المصابة بأكملها على وسط PDAC. واحتضان لوحات الثقافة في غرفة المناخ كما هو موضح سابقا.
بعد 14 يوما من الحضانة ، حدد أنواع EPF من خلال تحليل الخصائص المورفولوجية الكلية للثقافات الفطرية على الألواح كما هو موضح في المخطوطة. بعد ذلك ، انقل الكونيديا الهوائية إلى مزارع الانزلاق لمدة ثلاثة أيام عند رطوبة نسبية 80٪ و 25 درجة مئوية. بعد ثلاثة أيام تلطيخ الشريحة باللون الأزرق لاكتوفينول لمراقبة الميزات المجهرية.
تحت المجهر الضوئي ، راقب الهياكل الفطرية مثل الترتيب ، conidiophores ، شكل وحجم conidia في 400 مرة وتأكيد تحديد EPF. في الدراسة ، تم عزل 51 سلالة EPF من أنواع Metarhizium و Beaveria من 524 عينة تربة. يظهر التحليل التمثيلي الخصائص الميكرومورفولوجية لعدد قليل من العزلات من أنواع Metarhizium وأنواع Beaveria.
تمت دراسة حدوث EPF في عينات التربة ال 24 باستخدام ثلاث طرق مختلفة للعزل. أثبت طعم غاليريا ميلونيلا أنه أكثر كفاءة في العزلة ، يليه طعم تينيبريو موليتور ووسط CTC. ولم تظهر نفس عينات التربة البالغ عددها 24 عينة أي تعافي لأنواع بيفيريا، بل أظهرت فقط الميتاريزيوم.
أهم الأشياء التي يجب تذكرها هي نقل الكونيديا الهوائية إلى معطف منزلق يراقب ميزات المجهر ويؤكد تحديد الفطريات المسببة للأمراض الحشرية باستخدام مفاتيح مورفولوجية. وتشمل الطرق الإضافية استخدام وسائط اصطناعية انتقائية أخرى مع مواد كيميائية محددة للحد من نمو الملوثات مثل دودين. إن البحث عن عزلات فطرية جديدة ذات سمات مكافحة حيوية بارزة أمر بالغ الأهمية لزيادة فعالية الفطريات في مكافحة آفات المفصليات واستكشاف المزيد من الأسئلة في مجال علم أمراض اللافقاريات.
