엔토모병원성 진균의 분리는 생물농약 개발에 중요하며, 이 특정 집단의 다양성, 분포 및 생태학을 연구하는 데 도움이 될 수 있다. 곤충 미끼를 사용하여 엔토모 병원성 곰팡이를 분리하는 것은 저렴한 비용과 매우 효율적인 방법으로 간주됩니다. 클로람페니콜, 티아벤다졸, 시클로헥시미드, 인공 매체는 도딘을 사용하지 않으며 토양 샘플 공정에서 더 적은 공간을 필요로합니다.
중요한 단계에는 다른 곰팡이가 발달중인 곤충 병원성 곰팡이가 좁아지고 곤충 병원성 곰팡이가 생기는 것을 방지하기 위해 한 주와 두 주 후에 CTC 플레이트를 조사한 다음 매크로 형태학 및 마이크로 형태학을 기반으로 엔토모 병원성 곰팡이 식민지를 확인하는 것이 포함됩니다. 작은 삽을 사용하여 800 그램의 토양을 10 센티미터 깊이까지 수집하여 시작하십시오. 실험이 시작될 때까지 실온에서 폴리프로필렌 백에 샘플을 보관하십시오.
작은 뿌리는 또한 엔토모병원성 진균이 근권권 능력을 갖는 것으로 알려져 있기 때문에 수집될 수 있다. 클로람페니콜, 티아벤다졸, 시클로헥시미드 또는 CTC 선택적 인공 배지를 사용하여 곰팡이를 분리하려면 뿌리가 있거나없는 토양 샘플의 무게가 0.35 그램입니다. 이 샘플을 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 넣으십시오.
생물 안전 캐비닛에서 작업하는 동안 토양을 포함하는 마이크로 튜브에 멸균 0.01 부피 퍼센트 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 수성 현탁액 1 밀리리터를 넣고 튜브를 30 초 동안 와류시킵니다. 완료되면 CTC 배지로 페트리 플레이트의 중앙에 상층액 50 마이크로리터를 피펫팅하고 제거한다. 그런 다음 여섯 밀리미터 직경의 멸균 Drigalski 주걱을 사용하여 현탁액을 배지 표면에 균질하게 분산시킵니다.
플레이트를 섭씨 25도, 어둠 속에서 최소 80 %의 상대 습도로 기후 챔버에서 배양하십시오. 7일, 14일, 및 21일의 배양 후에, 진균 콜로니의 성장을 위한 플레이트를 관찰하였다. 표면 소독 된 갤러리아 멜로 넬라 (Galleria mellonella)와 테네브리오 몰리터 말기 유충을 곤충 미끼로 사용하여 곰팡이를 분리합니다.
유충을 0.5 % 차아 염소산 나트륨에 담그고 살균하십시오. 그런 다음 멸균 된 물로 애벌레를 두 번 씻으십시오. 수집 된 토양 250 그램이 들어있는 뚜껑에 직경 10 밀리미터의 작은 구멍 10 개가있는 플라스틱 냄비에 미끼를 조립하십시오.
격일로 토양을 균질화하여 애벌레와 토양이 최대한 접촉 할 수 있도록하고 매일 냄비를 분석하여 죽은 곤충을 찾습니다. 냄비에서 죽은 곤충을 제거한 후 곤충을 0.5 % 차아 염소산 나트륨으로 1 분 동안 피상적으로 살균하십시오. 진균증을 선호하려면 멸균 된 곤충을 7 일 동안 상대 습도 80 % 및 섭씨 25 도의 습한 챔버에 두십시오.
진균증에서 곤충 표면에서 conidia를 수확하고 미생물 학적 루프의 도움으로 0.05 % 클로람페니콜 또는 PDAC 배지를 함유 한 감자 덱스트로스 한천 배지에 코니디아를 입체 현미경으로 놓습니다. 대안으로, 감염된 전체 유충을 PDAC 배지 상에 놓는다. 배양 플레이트를 앞서 설명된 바와 같이 기후 챔버에서 인큐베이션한다.
배양 14일 후, 원고에 기재된 바와 같이 플레이트 상에서 진균 배양물의 거시적 형태학적 특성을 분석함으로써 EPF 종을 동정한다. 다음으로 공중 침엽수를 80 % 상대 습도 및 섭씨 25도에서 사흘 동안 슬라이드 배양물로 옮깁니다. 사흘 후 슬라이드를 락토페놀 블루로 염색하여 현미경 특징을 관찰하였다.
광학 현미경으로 400 배에서 conidia의 배열, conidiophores, 모양 및 크기와 같은 곰팡이 구조를 관찰하고 EPF 식별을 확인합니다. 이 연구에서, 메타리지움 및 비베리아 종의 51개의 EPF 균주를 524개의 토양 샘플로부터 분리하였다. 대표적인 분석은 메타리지움 종과 비베리아 종의 몇몇 단리물의 미세형태학적 특성을 보여준다.
24개의 토양 샘플에서 EPF의 발생은 세 가지 다른 분리 방법을 사용하여 연구되었다. 갤러리아 멜로 넬라 미끼는 격리에서 더 효율적인 것으로 판명되었으며, 테네브리오 몰리터 미끼와 CTC 배지가 그 뒤를 이었다. 동일한 24 개의 토양 샘플은 Beaveria 종의 회복은 보이지 않았지만 Metarhizium 만 나타났습니다.
기억해야 할 가장 중요한 것은 공중 침엽수를 슬라이드 코트로 옮겨 현미경 특징을 관찰하고 형태 학적 키를 사용하여 엔토모 병원성 곰팡이 식별을 확인하는 것입니다. 추가의 방법은 도딘과 같은 오염물의 성장을 감소시키기 위해 특정 화학물질과 함께 다른 선택적 인공 매체의 사용을 포함한다. 뛰어난 바이오 방제 특성을 가진 새로운 곰팡이 분리 물을 찾는 것은 절지 동물 해충 방제에서 곰팡이 효과를 높이고 무척추 동물 병리학 분야에서 더 많은 질문을 탐구하는 데 중요합니다.
