从土壤样品中分离昆虫致病真菌的方法比较

昆虫致病真菌的分离对于开发生物农药具有重要意义，并且有助于研究该特定群体的多样性，分布和生态学。使用昆虫诱饵来分离昆虫致病真菌被认为是一种低成本和高效的方法。氯霉素、噻苯达唑、环己酰亚胺、人工培养基不使用多丁，在土壤样品过程中需要的空间较小。

关键步骤包括在一周和两周后研究CTC板，以防止其他真菌变窄和发育中的昆虫致病真菌，然后根据其宏观形态和微观形态鉴定昆虫致病真菌菌落。首先用一把小铲子收集800克土壤到10厘米的深度。将样品在室温下储存在聚丙烯袋中，直到实验开始。

也可以收集小根，因为已知昆虫致病真菌具有根际能力。对于使用氯霉素，噻苯达唑，环己酰亚胺或CTC选择性人工培养基分离真菌，称量0.35克带或不带根的土壤样品。将此样品置于1.5毫升微管中。

在生物安全柜中工作时，向含有土壤的微管中加入一毫升无菌的0.01体积百分比聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯水悬浮液，并使管涡旋30秒。完成后，除去50微升上清液，用CTC培养基将50微升上清液滴到培养皿的中心。然后使用直径为六毫米的无菌Drigalski刮刀将悬浮液均匀地分散到介质表面上。

在25摄氏度和至少80%相对湿度的气候室中孵育板。在孵育7，14和21天后，观察板中真菌菌落的生长。使用表面消毒的Galleria mellonella和Tenebrio molitor晚期幼虫作为昆虫诱饵来分离真菌。

将幼虫浸入0.5%次氯酸钠中一分钟进行灭菌。然后用无菌水清洗幼虫两次。将诱饵组装在塑料盆中，在盖子上有10个直径为10毫米的小孔，其中包含250克收集的土壤。

每隔一天对土壤进行一次均质化，以允许幼虫与土壤的最大接触，并每天分析花盆，寻找死亡的昆虫。从锅中取出死虫后，用0.5%次氯酸钠对昆虫进行表面灭菌一分钟。为了有利于真菌病，将不育昆虫放在80%相对湿度和25摄氏度的潮湿室中七天。

在真菌病上，从昆虫表面收获分生孢子，并在微生物回路的帮助下，将分生孢子放在含有0.05%氯霉素或PDAC培养基的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在立体显微镜下。作为替代方案，将整个受感染的幼虫放在PDAC培养基上。如前所述，在气候室中孵育培养板。

孵育14天后，通过分析平板上真菌培养物的宏观形态学特征来鉴定EPF物种，如手稿中所述。接下来，将高空分生孢子转移到80%相对湿度和25摄氏度的滑梯培养物中三天。三天后用乳酚蓝染色载玻片以观察微观特征。

在光学显微镜下，观察真菌结构，如排列，分生孢子，形状和分生孢子的大小400次，并确认EPF鉴定。在这项研究中，从524个土壤样本中分离出51个EPF菌株的Metarhizium和Beaveria物种。代表性分析显示了Metarhizium物种和Beaveria物种的少数分离株的微形态学特征。

采用3种不同的分离方法研究了24个土壤样品中EPF的发生。事实证明，Galleria mellonella诱饵在隔离中更有效，其次是Tenebrio molitor诱饵和CTC培养基。同样的24个土壤样本显示海狸物种没有恢复，只有Metarhizium。

要记住的最重要的事情是将空中分生孢子转移到滑动涂层，观察显微镜特征并使用形态学键确认昆虫致病真菌的识别。其他方法包括使用具有特定化学物质的其他选择性人工培养基来减少多定等污染物的生长。寻找具有突出生物控制性状的新真菌分离物对于提高真菌在节肢动物 - 害虫控制中的有效性以及探索无脊椎动物病理学领域的进一步问题至关重要。