Die Isolierung entomopathogener Pilze ist für die Entwicklung eines Biopestizids von Bedeutung und kann hilfreich sein, um die Vielfalt, Verbreitung und Ökologie dieser speziellen Gruppe zu untersuchen. Die Verwendung von Insektenködern zur Isolierung entomopathogener Pilze gilt als kostengünstige und hocheffiziente Methode. Chloramphenicol, Thiabendazol, Cycloheximid, künstliche Medien verwenden kein Dodin und benötigen weniger Platz im Bodenprobenprozess.
Zu den kritischen Schritten gehören die Untersuchung von CTC-Platten nach einer und zwei Wochen, um zu verhindern, dass sich andere Pilze verengen und entomopathogene Pilze in der Entwicklung sind, und dann die Identifizierung entomopathogener Pilzkolonien basierend auf ihrer Makromorphologie und Mikromorphologie. Beginnen Sie mit dem Sammeln von 800 Gramm Erde bis zu einer Tiefe von 10 Zentimetern mit einer kleinen Schaufel. Lagern Sie die Proben in Polypropylenbeuteln bei Raumtemperatur bis zum Beginn des Experiments.
Kleine Wurzeln können auch gesammelt werden, da bekannt ist, dass entomopathogene Pilze eine Rhizosphärenkompetenz haben. Zur Isolierung von Pilzen mit Chloramphenicol, Thiabendazol, Cycloheximid oder CTC-selektivem künstlichem Medium werden 0,35 Gramm der Bodenprobe mit oder ohne Wurzeln gewogen. Legen Sie diese Probe in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen.
Während Sie in einer Biosicherheitskabine arbeiten, fügen Sie einen Milliliter sterile 0,01 Volumenprozent Polyoxyethylensorbitanmonooleat-wässrige Suspension zu dem Mikroröhrchen hinzu, das den Boden enthält, und wirbeln Sie das Rohr für 30 Sekunden ein. Entfernen und pipettieren Sie 50 Mikroliter des Überstands auf die Mitte der Petriplatten mit CTC-Medium. Verwenden Sie dann einen sterilen Drigalski-Spatel mit einem Durchmesser von sechs Millimetern, um die Suspensionen homogen auf die Oberfläche des Mediums zu verteilen.
Inkubieren Sie die Platten in Klimakammern bei 25 Grad Celsius und mindestens 80% relativer Luftfeuchtigkeit im Dunkeln. Nach sieben, 14 und 21 Tagen Inkubation beobachten Sie die Platten für das Wachstum von Pilzkolonien. Zur Isolierung der Pilze mittels oberflächendesinfizierter Galleria mellonella und Tenebrio molitor Spätstadium Larven als Insektenköder.
Tauchen Sie die Larve für eine Minute zur Sterilisation in 0,5% Natriumhypochlorit. Dann waschen Sie die Larven zweimal mit sterilem Wasser. Montieren Sie die Köder in Plastiktöpfen mit 10 kleinen Löchern von 10 Millimetern Durchmesser im Deckel, die 250 Gramm der gesammelten Erde enthalten.
Homogenisieren Sie den Boden jeden zweiten Tag, um maximalen Kontakt der Larven mit dem Boden zu ermöglichen, und analysieren Sie die Töpfe täglich, um tote Insekten zu suchen. Nachdem Sie tote Insekten aus dem Topf entfernt haben, sterilisieren Sie Insekten oberflächlich mit 0,5% Natriumhypochlorit für eine Minute. Um die Mykose zu begünstigen, legen Sie die sterilen Insekten sieben Tage lang in eine feuchte Kammer bei 80% relativer Luftfeuchtigkeit und 25 Grad Celsius.
Bei Mykose die Konidien von der Insektenoberfläche ernten und mit Hilfe der mikrobiologischen Schleife die Konidien auf Kartoffeldextrose-Agar-Medium, das 0,05% Chloramphenicol oder PDAC-Medium enthält, unter einem stereoskopischen Mikroskop platzieren. Als Alternative legen Sie die gesamte infizierte Larve auf das PDAC-Medium. Und inkubieren Sie die Kulturplatten in einer Klimakammer, wie bereits erläutert.
Identifizieren Sie nach 14 Tagen Inkubation die EPF-Arten, indem Sie die makromorphologischen Eigenschaften der Pilzkulturen auf den Platten analysieren, wie im Manuskript beschrieben. Als nächstes übertragen Sie die Luftkonidien für drei Tage bei 80% relativer Luftfeuchtigkeit und 25 Grad Celsius in Gleitkulturen. Nach drei Tagen färben Sie den Objektträger mit Lactophenolblau, um die mikroskopischen Merkmale zu beobachten.
Beobachten Sie unter einem optischen Mikroskop die Pilzstrukturen wie Anordnung, Konidiophoren, Form und Größe der Konidien beim 400-fachen und bestätigen Sie die EPF-Identifikation. In der Studie wurden 51 EPF-Stämme der Arten Metarhizium und Beaveria aus 524 Bodenproben isoliert. Die repräsentative Analyse zeigt die mikromorphologischen Eigenschaften einiger Isolate von Metarhizium-Arten und Beaveria-Arten.
Das Vorkommen von EPF in den 24 Bodenproben wurde mit drei verschiedenen Methoden der Isolierung untersucht. Galleria mellonella Köder erwiesen sich als effizienter in der Isolierung, gefolgt von Tenebrio Molitor Köder und CTC-Medium. Die gleichen 24 Bodenproben zeigten keine Erholung von Beaveria-Arten, sondern nur Metarhizium.
Die wichtigsten Dinge, an die man sich erinnern sollte, sind die Übertragung der Luftkonidien auf den Objektträger, wobei die Mikroskopmerkmale beobachtet und die Identifizierung entomopathogener Pilze anhand morphologischer Schlüssel bestätigt wird. Weitere Methoden umfassen die Verwendung anderer selektiver künstlicher Medien mit einer bestimmten Chemikalie, um das Wachstum von Verunreinigungen wie Dodin zu reduzieren. Die Suche nach neuen Pilzisolaten mit herausragenden Biokontrolleigenschaften ist entscheidend, um die Wirksamkeit von Pilzen bei der Arthropoden-Schädlingsbekämpfung zu erhöhen und weitere Fragen im Bereich der Pathologie wirbelloser Tiere zu untersuchen.
