El aislamiento de hongos entomopatógenos es significativo para el desarrollo de un bioplaguicida y puede ser útil para estudiar la diversidad, distribución y ecología de este grupo en particular. El uso de cebos de insectos para aislar hongos entomopatógenos se considera un método de bajo costo y altamente eficiente. cloranfenicol, tiabendazol, cicloheximida, medios artificiales no utiliza dodina y requiere menos espacio en el proceso de muestreo del suelo.
Los pasos críticos incluyen la investigación de las placas ctC después de una y dos semanas para evitar que otros hongos se estrechen y los hongos entomopatógenos en desarrollo, y luego identificar colonias de hongos entomopatógenos en función de su macromorfología y micromorfología. Comience recolectando 800 gramos de tierra a una profundidad de 10 centímetros usando una pala pequeña. Guarde las muestras en bolsas de polipropileno a temperatura ambiente hasta el inicio del experimento.
También se pueden recolectar raíces pequeñas ya que se sabe que los hongos entomopatógenos tienen competencia de rizosfera. Para el aislamiento de hongos utilizando cloranfenicol, tiabendazol, cicloheximida o medio artificial selectivo CTC, pese 0,35 gramos de la muestra de suelo con o sin raíces. Coloque esta muestra en un microtubo de 1,5 mililitros.
Mientras trabaja en un gabinete de bioseguridad, agregue un mililitro de suspensión acuosa estéril de polioxietileno sorbitano monooleato al microtubo que contiene el suelo y vórtice el tubo durante 30 segundos. Cuando haya terminado, retire y pipetee 50 microlitros del sobrenadante en el centro de las placas de Petri con medio CTC. Luego use una espátula estéril de Drigalski de seis milímetros de diámetro para dispersar homogéneamente las suspensiones en la superficie del medio.
Incubar las placas en cámaras climáticas a 25 grados centígrados y un mínimo de 80% de humedad relativa en la oscuridad. Después de siete, 14 y 21 días de incubación, observe las placas para el crecimiento de colonias de hongos. Aislar los hongos utilizando larvas de galleria mellonella y Tenebrio molitor desinfectadas superficialmente como cebos para insectos.
Sumerja la larva en hipoclorito de sodio al 0,5% durante un minuto para la esterilización. Luego lave las larvas dos veces con agua estéril. Ensamble los cebos en macetas de plástico con 10 pequeños orificios de 10 milímetros de diámetro en la tapa que contengan 250 gramos de la tierra recolectada.
Homogeneizar el suelo cada dos días para permitir el máximo contacto de las larvas con el suelo y analizar las macetas diariamente, buscando insectos muertos. Después de eliminar los insectos muertos de la olla, esterilice superficialmente los insectos con hipoclorito de sodio al 0.5% durante un minuto. Para favorecer la micosis, coloque los insectos estériles en una cámara húmeda al 80% de humedad relativa y 25 grados centígrados durante siete días.
En la micosis, recolecte los conidios de la superficie del insecto y, con la ayuda del asa microbiológica, coloque los conidios en un medio de agar de dextrosa de papa que contenga 0.05% de cloranfenicol o medio PDAC bajo un microscopio estereoscópico. Como alternativa, coloque las larvas infectadas enteras en el medio PDAC. E incubar las placas de cultivo en una cámara climática como se explicó anteriormente.
Después de 14 días de incubación, identificar las especies de EPF analizando las características macromorfológicas de los cultivos de hongos en las placas como se describe en el manuscrito. A continuación, transfiera los conidios aéreos a cultivos deslizantes durante tres días al 80% de humedad relativa y 25 grados centígrados. Después de tres días, tiñe el portaobjetos con azul lactofenol para observar las características microscópicas.
Bajo un microscopio óptico, observe las estructuras fúngicas como la disposición, los conidióforos, la forma y el tamaño de los conidios a 400 veces y confirme la identificación de EPF. En el estudio, se aislaron 51 cepas de EPF de las especies Metarhizium y Beaveria de 524 muestras de suelo. El análisis representativo muestra las características micromorfológicas de algunos aislados de especies de Metarhizium y Beaveria.
La ocurrencia de EPF en las 24 muestras de suelo se estudió utilizando tres métodos diferentes de aislamiento. El cebo Galleria mellonella demostró ser más eficiente en el aislamiento, seguido por el cebo Tenebrio molitor y el medio CTC. Las mismas 24 muestras de suelo no mostraron recuperación de especies de Beaveria, sino solo Metarhizium.
Las cosas más importantes a recordar son transferir los conidios aéreos a la capa deslizante observando las características del microscopio y confirmando la identificación de hongos entomopatógenos utilizando claves morfológicas. Los métodos adicionales incluyen el uso de otros medios artificiales selectivos con productos químicos específicos para reducir el crecimiento de contaminantes como la dodina. La búsqueda de nuevos aislados de hongos con rasgos de control biológico sobresalientes es crucial para aumentar la efectividad de los hongos en el control de plagas de artrópodos y explorar más preguntas en el campo de la patología de los invertebrados.
